腋臭患者ApoD表达变化及其分子机制的研究(1)
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[摘要]目的：观察与E-3M2H分泌相关的载脂蛋白D(ApoD)和雄激素受体AR在腋臭患者的大汗腺的表达与正常人的差异，探讨导致腋臭患者ApoD表达异常的原因。方法：收集4例正常对照和10例腋臭患者的组织样本，采用免疫组化、realtime-PCR和western-blot检测腋臭患者组织中ApoD、AR的表达水平，通过细胞培养和激素诱导，分析AR信号调控ApoD表达的可能性，并阐明JNK1信号通路在其中扮演的作用。结果：实验发现ApoD和AR在腋臭患者的大汗腺的表达与正常人有明显的差异，腋臭患者中ApoD表达几乎是正常人的2倍；而腋臭患者中AR表达也明显增加，与此同时，腋臭患者中JNK1活化增强。雄激素可以增强正常人ApoD的表达，且该过程中同样伴有JNK1活化；抑制JNK1活化，可以降低腋臭患者和雄激素诱导的ApoD的表达。结论：ApoD表达增加是腋臭患者的重要分子特征，其表达增加与AR 信号增强密切相关。JNK1的活化是腋臭患者和雄激素导致的ApoD表达增加的重要原因，抑制JNK1活化，可以抑制腋臭患者内源和雄激素诱导的ApoD的表达。
[关键词]腋臭；载脂蛋白D(ApoD)；JNK；表达调控
[中图分类号]R758.74 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2012)11-1956-05
腋臭是整形美容外科的常见病，给患者带来很大的精神和心理压力，影响正常的生活和工作。目前治疗腋臭的方法很多，治疗效果多不相同，具有一定的创伤和并发症。进一步阐明腋臭发生的分子机制，在深入认识腋臭发生病理机制的同时，有望发现无创治疗腋臭的新手段，对腋臭治疗具有重要的意义。研究表明，(E)-3-甲基-2-已烯酸(E-3M2H)的分泌在腋臭发生过程中具有重要作用，而载脂蛋白D(ApoD)是调控其分泌的重要分子。然而，腋臭患者中ApoD的表达情况及其与腋臭的关系尚不清楚。深入分析腋臭患者中ApoD的表达及其机制，对于认识腋臭的发生具有重要的意义。本研究将集中探讨腋臭患者AR和ApoD的表达变化及其相关性；分析AR信号是否可能调节大汗腺中ApoD的表达，特别是JNK1信号在其中扮演的可能角色。
1 材料和方法
1.1 临床样本收集：收集2009年10月到2010年5月在第四军医大学唐都医院整形激光美容中心手术治疗腋臭的男性患者腋下组织标本10例，同时募集4例男性志愿者(瘢痕修复患者或其他原因)。术中取患者左右两侧腋下新鲜皮肤组织约6cm×0.3cm×0.3cm(深及脂肪层)。
1.2 细胞培养：取自患者和志愿者的腋窝处皮肤经D-Hanks液冲洗后，剔除脂肪组织。用眼科手术剪将皮肤剪成1mm3的小组织块。然后用II型胶原酶孵箱中消化1天。1天后，镜下获取汗腺组织，移入新的培养瓶中培养，加入少许培养基，待汗腺组织块贴壁后继续加入2ml培养基继续培养。 每2～3天换液一次。通常汗腺上皮中混有成纤维细胞，而后者与汗腺上皮相比，贴壁较差。 为了纯化汗腺上皮细胞，通过胰酶分步消化的方法获取汗腺上皮细胞。胰酶消化后，首先脱落的是成纤维细胞，吸弃后，继续消化依然贴壁的汗腺上皮，则能获取较为纯的汗腺上皮细胞。整个过程中，细胞培养采用DMEM+10% FBS。
1.3 细胞处理
1.3.1 JNK抑制剂处理：将上述培养的腋臭患者细胞铺板于6孔板，隔夜培养，待细胞长至70%后给予JNK抑制剂处理，抑制剂浓度为10-6M，继续培养24h后，收集细胞用于基因表达检测。
1.3.2 5α-DHT处理：将培养的正常人细胞铺板于6孔板，隔夜培养，待细胞长至70%后给予5α-DHT 处理，剂量分别为10-7M 和10-6M 。此外，我们还在10-6M 浓度的5α-DHT基础上联合添加JNK抑制剂处理，抑制剂浓度为10-6M，继续培养24h后，收集细胞用于基因表达检测。
1.4 Western Blot检测目的基因表达
1.4.1 收集蛋白样品(Protein sample preparation)：将处理完的细胞，PBS洗涤后，按每孔加入80μl的RIPA蛋白裂解液，冰上孵育30min。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，采用Pierce 公司的BCA蛋白定量试剂盒测定每个蛋白样品的蛋白浓度。将适量浓缩的5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液加入收集的蛋白样品中。沸水浴加热3～5min，以充分变性蛋白，离心后取上清备用。
1.4.2. 电泳(Electrophoresis)：首先配制SDS-PAGE凝胶，制备好后，把蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内。为便于观察电泳和转膜效果、判断蛋白分子量大小，在边缘加样孔中加入预染蛋白质分子量Marker。
1.4.3 转膜(Transfer)：本实验中使用硝酸纤维素膜(NC膜)进行转移。转移条件为：电流为200mA，转膜时间为120min。整个过程在冰浴中进行。根据预染蛋白质分子量Marker，判断转膜的效果。
1.4.4 封闭(Blocking)：转膜完成后 ......
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