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编号:12332151
氨甲喋呤对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的影响(2)
http://www.100md.com 2012年11月1日 张建军 陈发国 吴毅平
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    参见附件。

     2 结果

    2.1 药物对细胞的毒性作用:氨甲喋呤作用24h后,10-9mol/L、10-8mol/L浓度氨甲喋呤培养上清中LDH活性与对照组比较差异均无显著性(P>0.05);而10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L浓度氨甲喋呤与空白对照组比较,结果差异均有显著性 (P<0.01)(见表1)。提示:高于10-7mol/L浓度的氨甲喋呤均表现出对增生性瘢痕成纤维细胞的细胞毒性作用。

    2.2 药物对细胞增殖的影响:10-6mol/L、10-5mol/L浓度氨甲喋呤药物组分别与空白对照组比较差异均有显著性(P=0.000),而10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L浓度氨甲喋呤药物组分别与对照组比较差异均无显著性(P>0.05)(见表2)。提示:高于10-6mol/L浓度的氨甲喋呤能显著抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖,而低于10-6mol/L浓度的氨甲喋呤却未表现出此抑制作用。

    2.3 药物对瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响:各浓度氨甲喋呤药物组与空白对照组之间差异均有显著性(P<0.01)(见表3)。提示:10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L浓度的氨甲喋呤均抑制了增生性瘢痕成纤维细胞胶原蛋白的合成。

    3讨论

    成纤维细胞在瘢痕形成过程中起着至关重要的作用,它是形成肉芽组织、合成胶原等细胞外基质、进行伤口重塑的重要细胞[2,8],成纤维细胞的异常增殖和过度合成或分泌胶原蛋白的功能受到普遍关注。

    氨甲喋呤对增生性瘢痕中成纤维细胞是否有直接作用,目前还尚未见到文献报道。MTT法是目前常用的检测细胞增殖和活力的方法,可以通过吸光度值的高低反映活性细胞的浓度。本试验MTT比色法结果显示10-6mol/L、10-5mol/L浓度药物组的吸光度值较对照组有一定程度的下降,与对照组有显著性差异(P<0.01),提示10-6mol/L、10-5mol/L浓度的氨甲喋呤对成纤维细胞的增殖有一定的抑制作用,这与安振梅报道的氨甲喋呤对人眼球后成纤维细胞增殖的抑制作用结果基本一致[9]。

    乳酸脱氢酶是所有细胞的胞浆内均存在的细胞内酶,细胞膜受损时可迅速释放到细胞外,故可作为细胞毒性检测的一项敏感指标。我们测定了细胞上清液中的LDH值,结果氨甲喋呤作用24h后,10-9mol/L、10-8mol/L浓度氨甲喋呤培养上清中LDH活性与对照组比较差异均无显著性(P>0.05);而10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L浓度氨甲喋呤与空白对照组比较,结果差异均有显著性(P<0.01)(见表1)。提示:高于10-7mol/L浓度的氨甲喋呤均可能损伤了部分瘢痕成纤维细胞的细胞膜,而表现出其细胞毒性作用。

    羟脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸,含量相对恒定,占胶原中总氨基酸的13.4%,而一般蛋白质含量极微,故羟脯氨酸的测定值可间接反映胶原蛋白的合成情况。我们的实验检测了细胞上清液[7]中的羟脯氨酸的含量,结果显示:在本实验条件下,10-9mol/L~10-5mol/L浓度的氨甲喋呤可使细胞上清液中的羟脯氨酸含量显著降低(P<0.01),据此计算出的胶原蛋白含量,与对照组相比呈显著性降低(P<0.01),这间接反映出对增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成的抑制作用。另外,在本实验结果中10-9mol/L~10-7mol/L浓度的氨甲喋呤虽然并未表现出对成纤维细胞的抑制作用,但却抑制了胶原的合成,也提示氨甲喋呤可能存在的临床应用前景。

    氨甲喋呤是一种有效的抗肿瘤药物,它是二氢叶酸还原酶抑制剂,可阻止二氢叶酸向四氢叶酸转化,使细胞DNA合成障碍,干扰RNA和蛋白质的生物合成,其主要作用于S期细胞,尤其对于处于对数增殖期的细胞作用最强,我们选取的瘢痕成纤维细胞处于增殖旺盛的对数生长期,体外实验中氨甲喋呤对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原合成的抑制作用机制可能与此有关。另外,氨甲喋呤对细胞增殖的调控也可通过诱导细胞凋亡发挥作用[4],我们通过MTT、LDH测定实验结合显微镜下观察发现,10-6mol/L、10-5mol/L浓度的氨甲喋呤影响了细胞的活性,对部分细胞的细胞膜产生了损伤,但这部分成纤维细胞究竟是发生了坏死还是凋亡目前还不清楚,需要通过进一步实验来确定。

    氨甲喋呤被用于儿童并指畸形术后瘢痕疙瘩的预防和治疗,疗效满意[10],但未见到氨甲喋呤治疗增生性瘢痕的报道。结合本实验结果,氨甲喋呤虽然在体外可抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原合成,临床治疗瘢痕疙瘩也发挥了治疗作用,但其潜在的治疗增生性瘢痕的作用可能会由于它的细胞毒性作用而受到一定的限制。

    氨甲喋呤作为一种免疫抑制剂,临床用于治疗硬皮病[3,11]、难治性的牛皮癣、结节病和类风湿关节炎[12]。瘢痕增生过程中局部免疫反应活跃,氨甲喋呤是否可通过抑制局部增强的免疫反应来间接调控增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成,促进瘢痕的消退,需要今后的实验去证实 ......

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