氨甲喋呤对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的影响(1)
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[摘要]目的：探讨氨甲喋呤对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。方法：以体外培养的人瘢痕成纤维细胞为实验模型，将氨甲喋呤(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)加入细胞培养液中进行干预并与空白对照组比较，用乳酸脱氢酶实验检测药物的细胞毒性，并通过MTT实验和羟脯氨酸测定实验分别检测药物对成纤维细胞增殖活性和胶原合成的影响。结果：10-6mol/L、10-5mol/L的氨甲喋呤对成纤维细胞的生长有抑制作用，与对照组比较差异有显著性(P<0.01)，10-9mol/L～10-5mol/L的氨甲喋呤对瘢痕成纤维细胞胶原合成具有抑制作用(P<0.01)。结论：氨甲喋呤在体外对瘢痕成纤维细胞细胞增殖和胶原合成具有抑制作用。
[关键词]氨甲喋呤；增生性瘢痕；成纤维细胞；细胞增殖；胶原合成
[中图分类号]R619+.6 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2012)11-1961-03
增生性瘢痕是多种致伤因素对真皮组织作用后创面异常愈合的不良结局，不仅可伴有疼痛、瘙痒等不适症状，过度的增生还可以造成机体外形改变和功能障碍，进而影响患者的生活质量，对患者生理和心理造成损害，临床治疗效果目前多不令人满意[1]，如何防治瘢痕的形成，一直是近年来的研究热点之一。病理性瘢痕的形成机制异常复杂，已有的研究提示[2]：它是一个多种因素作用下的纤维化过程，其中(肌)成纤维细胞的异常增殖以及其胶原的过度合成在其中发挥了重要的作用，已成为人们选择治疗的重要靶点。因此，从抑制成纤维细胞增殖和胶原代谢的方面寻找治疗和预防瘢痕增生药物具有重要意义。氨甲喋呤具有抗增殖和免疫抑制的双重药理作用，在对纤维化皮肤病诸如侵袭性纤维瘤[3]的治疗中也发挥了一定的治疗作用。我们通过以体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞作为实验对象，观察氨甲喋呤对瘢痕成纤维细胞增殖及胶原合成的影响，为探讨氨甲喋呤在治疗增生性瘢痕方面的临床应用价值提供实验和理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1实验药物：氨甲喋呤：DMEM溶解后滤过除菌(0.2μm滤膜)，配制成10-3mol/L浓度母液，置-20℃冰箱避光保存，贮存备用。临用时用无血清DMEM分别稀释成0、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L[4]。
1.1.2主要仪器和试剂：DMEM：美国Gibco公司；MTT、胰蛋白酶：华美公司；小牛血清：浙江三立公司；DMSO上海Sangon公司；羟脯氨酸试剂盒：南京建成生物制品有限公司。OLYMPUS-IX71型倒置相差显微镜(日本)、Form Scientific CO2孵箱(美国)、BIO-RAD550型酶联免疫检测仪(美国)、HITACHI7176S型全自动生化分析仪(日本)、TU-1800紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。
1.1.3标本来源：增生性瘢痕成纤维细胞来源于手术中切下的增生性瘢痕，共3例(女2，男1)， 年龄1～25岁，取材部位分别为手部、颈部、髂腰部，病程分别为10个月、12个月、13个月，近期无使用瘢痕治疗药物史，不伴有肿瘤或其它严重疾病。
1.2 实验方法
1.2.1人成纤维细胞培养：用组织块法[5]进行成纤维细胞培养：无菌条件下进行漂洗、剪碎，接种于含10%新生牛血清(NCS)的DMEM培养液中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的CO2孵箱中培养。待细胞从组织块中长出并接近融合成单层时用0.125% 胰蛋白酶消化， 1： 2 传代。本实验所用细胞为4～6代。实验按照药物浓度分为空白对照组0(为不含药物的DMEM培养液)和实验组：10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L。
1.2.2 乳酸脱氢酶(LDH) 的测定：取4～8代对数生长期细胞，血细胞计数板计数，用含10%NCS的DMEM培养液调整细胞密度为2.5×104/ml，用24孔培养板培养，每孔接种1ml即2.5×104个细胞，置CO2孵箱内培养24h，每一药物浓度组及相应对照组均设6个复孔，按实验药物分组加入条件培养液1ml，继续培养24h，取上清，用全自动生化分析仪测定LDH活性值。
1.2.3 MTT比色法测定细胞增殖状况：MTT法参照Hansen[6]的方法略作修改，取4～8代对数生长期细胞，血细胞计数板计数，用含10%NCS的DMEM培养液调整细胞密度为5×104/ml，用96孔板培养，每孔加入100μl即5×103个细胞，置CO2孵箱中培养24h，吸弃上清，每一药物浓度组及相应对照组均设8个复孔，2个无细胞对照孔，按实验药物分组加入条件培养液100μl，继续培养24h，吸弃上清10μl加入MTT液10μl/孔(MTT5g/L)继续培养4h，弃上清，每孔加入DMSO100μl，振荡10min ......
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