人牙周细胞压力作用下Hif—1alpha及Rankl/Opg变化(1)
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[摘要]目的：探讨过大压力对人牙周膜细胞三维微球中Hif-1 alpha和Rankl/Opg表达的影响。方法：体外构建人牙周膜细胞三维微球，压力组给予0.2 MPa， 4 h静态压力，对照组不给予额外压力，实时定量PCR检测Hif-1 alpha、Rankl和Opg表达。结果：压力组人牙周膜细胞微球Hif-1 alpha和Rankl mRNA 表达增加，而Opg mRNA表达降低。结论：过大压力可以使人牙周膜细胞上调Hif-1 alpha并且升高Rankl/Opg mRNA比值，使其分泌的因子向促破骨方向发展。
[关键词]人牙周膜细胞微球；压力；Hif-1 alpha ；Rankl/Opg
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2012)11-1964-03
牙周炎是口腔疾患中的常见疾病，牙槽骨吸收是其的主要临床表现之一，严重者可导致牙齿松动或脱落。在引起破骨过程中，Rankl/Opg之间的平衡起着主要作用，Rankl作为分泌性因子与破骨前体细胞或破骨细胞膜上表达的Rank受体结合而诱导破骨细胞的分化、成熟和破骨功能，而Opg是分泌性同Rankl结合的假受体，其与Rankl结合而抑制破骨活动[1]。
体内实验及体外人牙周膜细胞二维培养实验等提示人牙周膜细胞可能是Rankl/Opg来源而影响牙周炎中牙槽骨的改建[2-7]。咬合创伤常常是牙周炎的协同致病因素，过大的咬合力量导致牙槽骨吸收，体外试验也显示人牙周膜细胞能够感受机械信号而调节Rankl/Opg表达[8-14]。Hif-1 alpha是细胞感受乏氧的重要转录因子[15]，外界力学信号也可以改变其表达[17-19]，而最近研究表明Hif-1 alpha可以直接诱导Rankl的表达[20]。
采用高密度细胞自行在非贴壁的琼脂孔内形成无支架的三维细胞块已经用于软骨和纤维软骨的组织工程研究[21-22]，本研究采用高密度的人牙周膜细胞微球三维培养和压力加载系统观察压力对Hif-1 alpha和Rankl/Opg的影响，以其模拟过大咬合力对牙周膜细胞在牙槽骨改建中的作用。
1 材料和方法
1.1 人牙周膜细胞的分离培养：参考[23]的方法，无菌条件下刮取健康男性正畸拔牙的双尖牙牙根表面中1/3的牙周膜，以组织块酶消化法得到原代人牙周膜细胞。牙周膜细胞常规培养于含20%胎牛血清的DMEM。待细胞汇聚80%左右后，0.25%胰酶消化传代。P3代的人牙周膜细胞用于构建细胞微球。
1.2 人牙周膜细胞微球的构建和加压：参照Johns 等[21]的方法，先将消毒融化的2%的琼脂糖注入到24孔板的孔内，然后将粘有24个直径5mm×高10mm的不锈钢圆柱体盖板适合于24孔，琼脂糖在室温下1h左右结成凝胶，分离附有不锈钢圆柱体的24孔板盖板，形成24孔直径5mm×高10mm的琼脂孔，琼脂孔被完全培养液饱和置换出琼脂糖内含的PBS。每孔把2×106个P3代人牙周膜细胞悬于100μl完全培养基中，细胞不能贴壁于琼脂糖孔，也不能长入其中，琼脂孔内每天换液50μl， 1w后细胞将自行聚集形成将人牙周膜细胞微球。
压力装置采用任利玲等[24]的加压系统，将人牙周膜细胞微球置于加有完全培养基5 ml注射器中，注射器固定在超净台内中的加压装置上，维持于37℃恒温水浴箱中。注射器通过活塞运动压缩空气产生静水压作用于人牙周膜细胞微球。将形成的人牙周膜细胞微球随机分成两组：压力组给予0.2 MPa， 4h的静态压力，对照组给予4h除不加力外，其它培养条件同加压组，加力后进行大体观测，每组设4个样本。
1.3 实时定量RT-PCR检测Hif-1 alpha和Rankl/Opg的表达：将加力后的人牙周膜细胞微球用Trizol试剂盒(Invitrogen， Carlsbad， CA， USA)提取总RNA， 按照PrimeScriptR RT Master Mix (Perfect Real Time， Takara， 大连)反转录试剂盒反转录成cDNA，实时定量按照PCR SYBRR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time， Takara， 大连)试剂盒利用Applied Biosystems 7500 PCR系统。目的基因的引物序列如下：Hif-1 alpha上游引物： GCTGGCCCCAGCCGCTGGAG，Hif-1 alpha下游引物： GAGTGCAGG GTCAGCACTAC； Rankl上游引物： CGTTGGATCACAGCACATCAG， Rankl下游引物： GTACCAAGAGGACAGACTCAC； OPG上游引物： CACTACTACACAGACAGCTGG， Opg下游引物：ACTCTATCTCAAGGTA GCGCC； Gapdh上游引物： GTCTTCACCACCATGGAGAAG ......
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