翼状胬肉中MMP—2和Ki—67的表达及临床意义(1)
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[摘要]目的：研究基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和Ki-67在翼状胬肉组织中的表达及临床意义。方法：应用辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素免疫组织化学方法(S-P法)对39例原发性翼状胬肉及12例正常球结膜组织中的MMP-2及Ki-67蛋白进行检测。结果：MMP-2及Ki-67蛋白在翼状胬肉组织中的表达均高于正常结膜组，差异有显著性意义(Z=-3.044，Z=-2.707，P均<0.05)。结论：MMP-2及Ki-67在翼状胬肉中的表达明显高于正常球结膜，提示翼状胬肉组织中基底膜分解代谢和细胞增殖调控等方面发生异常了变化，在翼状胬肉的发生发展中可能起着重要的作用。
[关键词]翼状胬肉；MMP-2；Ki-67；免疫组织化学
[中图分类号]R777.33 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2012)11-1971-03
翼状胬肉是临床常见眼表病之一，发病普遍认为与紫外线照射、气候干燥、接触粉尘油烟等有关。表现为呈三角形增厚的球结膜组织病变，头部侵袭生长至角膜，导致病人视功能下降，但其确切的发病机制至今仍不甚明了[1]。基质金属蛋白酶2(MMP-2)是MMps家族成员之一，对细胞外基质(ECM)有广泛的降解作用。MMP-2在翼状胬肉中参与ECM的破坏及新生血管的形成而备受关注。Ki-67是存在于增殖细胞核基质内的抗原，其增殖指数可以敏感地反映出细胞的增殖活性。翼状胬肉组织存在异常增殖调控，使胬肉上皮及间质细胞和正常结膜处于不同细胞分裂周期。我们运用免疫组织化学技术，检测39例翼状胬肉，12例正常球结膜标本中MMP-2和Ki-67的表达，探讨其在翼状胬肉组织中的表达情况，从分子水平进一步探讨翼状胬肉发病机制，为胬肉的化学药物治疗和靶向治疗提供一定的思路。
1 材料和方法
1.1 标本来源：收集原发性翼状胬肉组织标本39例，来自于2009年3月～2009年7月在河北省眼病治疗中心进行翼状胬肉切除术的患者。其中男性21例，女性18例；平均年龄60.5岁；静止期12例，进展期27例。病程6个月～30年不等；生长部位：鼻侧38例，颞侧1例；对照组取正常球结膜12例，取材部位为鼻侧睑裂部近角巩膜缘球结膜组织。其中男性7例，女性5例；平均年龄41.2岁。所有病例术前均排除其他角膜及结膜疾病，近3个月无眼部用药史及手术史。
1.2 实验试剂：鼠抗人MMP-2单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司(产品编号sc-13595)；鼠抗人Ki-67单克隆抗体浓缩液(北京中杉金桥生物技术有限公司)，产品编号ZM-0166；S-P免疫组化试剂盒、浓缩型显色剂二氨基联苯胺(DAB)试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 方法：免疫组织化学染色(S-P法)：标本经10%中性福尔马林固定24h后进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋。5μm连续切片后，经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水；于湿盒内用3%H2O2溶液室温孵育20min去除内源性过氧化氢酶；枸橼酸盐缓冲液微波抗原热修复；正常山羊血清封闭；分别滴加由0.01M PBS稀释的MMP-2及Ki-67的一抗，工作浓度均为1：50；切片放入湿盒中，4℃冰箱过夜；分别滴加生物素标记的二抗工作液及辣根酶标记链霉卵白素工作液， 37℃温箱孵育30min；DAB显色，显微镜下观察显色情况，自来水充分冲洗中止显色。苏木素复染，常规脱水透明封片。以0.01M 磷酸盐缓冲液(PBS)液替代一抗做阴性对照，将已知阳性切片作为阳性对照。
1.4结果判定 MMP-2的表达情况根据染色强度及染色阳性细胞的百分率来计分。阳性细胞数≤10%为0分；在10%～25%为1分；在26%～50%为2分；>51%为3分；染色强度计分标准：无色计0分；淡黄色计1分；棕黄色计2分；黄褐色计3分。分值计算：将两种计分结果相乘并分为以下等级：0分：为阴性(-)；1～2分：为弱阳性(+)；3～4分：为阳性(++)；5分～：为强阳性(+++)。Ki-67定位于细胞核，阳性反应为细胞核呈棕褐色、颗粒状。Ki-67蛋白评分标准：在400倍视野下计数500个细胞，阳性细胞<5%为阴性(-)，5%～25%为弱阳性(+)，26%～50%为阳性(++)，>50%为强阳性(+++)。>25%即为Ki-67高表达。
1.5统计学方法 所有数据采用SPSS15.0统计软件包进行秩和检验和Spearman等级相关分析。以a=0.05为检验水准，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 MMP-2蛋白的表达 正常球结膜组织中未见MMP-2表达(图1)，翼状胬肉组织中MMP-2呈阳性表达，阳性物质位于近基底部的上皮层细胞的胞浆中，呈弥漫性或散在分布的棕黄色或棕褐色颗粒状(图2)，差异有显著性意义(P<0.05) (表1)。39例翼状胬肉标本中，静止期MMP-2阳性表达率为50%(6/12)，进展期阳性表达率为51.8%(14/27)，静止期和进展期MMP-2阳性表达率比较无显著性差异(P>0.05)。不同性别和不同年龄组MMP-2阳性表达亦无显著性差异(P>0.05)(表1) ......
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