SFRP2基因重组腺病毒载体的构建与鉴定(2)
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1.2.5 SFRP2重组腺病毒感染增生性瘢痕成纤维细胞：原代培养的增生性瘢痕成纤维细胞经第3次传代后，在150 mL/LDMEM中培养24h。将Ad-SFRP2纯化病毒按其TCID50值加入到细胞培养基中，每15min轻摇1次，共4次，4h后换液。
1.2.6 RT-PCR检测SFRP2表达水平：按Trizol试剂盒说明书分别提取Ad-SFRP2感染24h后的实验组和阴性对照组增生性瘢痕成纤维细胞的总RNA。RT-PCR反应按照Fermentas反转录PCR试剂盒说明书进行操作，利用PrimerPrimer 5.0设计SFRP2的鉴定引物：上游5'-TGGGGGAAACGGTCGCACTC-3'，下游5'-GGCCACGAGACCATGAAGGAGG-3′。 PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃40s，35个循环；最后延伸72℃5 min。以GAPDH作为内参照(退火温度55℃，25个循环)，GAPDH上游引物5'-ACCCATCACCATCTTCCA GGAG-3'，下游引物5'-GAAGGGGCGGAGATGATGAC-3'(上海生物工程技术服务有限公司合成)，PCR反应结束后取10μL反应产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察目的条带。
1.2.7 Western blot检测SFRP2表达水平：分别收集感染Ad-SFRP2 24h后和对照组细胞，提取蛋白。BCA法进行蛋白定量，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，沸水浴5min，按照蛋白定量结果进行加样，行120g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用半干法将蛋白转移至硝酸纤维素(NC)膜上。NC膜用50g/L脱脂奶封闭1h，加入SFRP2 pAb (1∶500)或GAPDH mAb(1∶1000)工作液，4℃过夜，兔抗人二抗(1∶4000)于室温下孵育1h，用ECL发光，胶片显色，分析结果，以GAPDH作为内参照。
2 结果
2.1 PCR扩增产物电泳结果：以pGBKT-SFRP2质粒为模板，PCR扩增产物为单一条带，大小约904bp，见图1。
2.2 SFRP2重组腺病毒载体的构建：将扩增产物克隆入pMD19-T载体，BglII和SalI双酶切和PCR鉴定确认获得阳性重组克隆(图2)。进而将SFRP2片段亚克隆至pAdTrack-CMV载体，BglII和SalI双酶切鉴定并经测序确认获得阳性重组克隆，命名为pAdTrack-CMV-SFRP2(图3、图4)。线性化的pAdTrack-CMV-SFRP2质粒与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组，PacⅠ酶切鉴定阳性重组子，可见1条约30 kb的片段和1条4.5 kb的小片段(图5)，表明同源重组成功，获得SFRP2重组腺病毒载体，命名为Ad-SFRP2。同时，采用同样方法，将pAdTrack-CMV空载体与骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组，重组子命名为Ad-EGFP。
2.3 SFRP2重组腺病毒的包装扩增及鉴定：用脂质体转染293细胞有大量GFP表达，并可见细胞变圆呈串珠样聚集(图6)，裂解粗提物中提取重组病毒DNA，PCR鉴定证实重组病毒基因组中含有目的基因SFRP2，提示重组质粒在293细胞转染成功。收集病毒液，反复转染293细胞最终得到滴度约为2.0×1010pfu/mL的重组腺病毒。
2.4 RT-PCR检测结果：感染的增生性瘢痕成纤维细胞中提取mRNA的RT-PCR电泳结果显示，以GAPDH为阳性对照，未感染病毒的增生性瘢痕成纤维细胞SFRP2、感染空病毒的增生性瘢痕成纤维细胞SFRP2与感染SFRP2腺病毒的增生性瘢痕成纤维细胞SFRP2表达一致。其产物为904bp特异条带，且SFRP2腺病毒感染增生性瘢痕成纤维细胞后SFRP2基因表达明显增高(图7)。
2.6 Western blot检测结果：用SFRP2多克隆抗体进行Western blot检测，以GAPDH为阳性对照，结果证实感染重组腺病毒载体在增生性瘢痕成纤维细胞中SFRP2有较高的稳定表达(图8)。
3 讨论
SFRP2是一个位于4号染色体q31.3，其全长约2kb，编码大小约34kD的可溶性蛋白质，表达于胞浆，但也可分泌至胞外发挥作用。SFRP2蛋白所属的SFRP家族具有富含半胱氨酸的结构域，该结构域同源于细胞表面卷曲受体(Frizzled receptors)的Wnt结合位点，但是SFRP2缺乏跨膜结构[5]。目前的研究表明，SFRP2通过调控Wnt信号为主要途径的方式发挥其调节细胞抗凋亡的作用。表现为：①心肌修复过程中，SFRP2通过阻断Wnt3a信号途径、增加细胞核内β-catenin表达以对抗缺氧/复氧诱导的凋亡作用，从而调控心肌细胞修复[6]；②胃癌中过表达的SFRP2通过下调β-catenin-TCF/LEF的下游靶基因如LEF1 ......
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