SFRP2基因重组腺病毒载体的构建与鉴定(1)
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[摘要]目的：成功构建携带SFRP2基因的腺病毒载体。方法：从pGBKT-SFRP2质粒中扩增SFRP2基因，将SFRP2基因亚克隆至质粒穿梭载体pAd-Track-CMV。用脂质体转染法将重组腺病毒pAd-Track-PPARγ2-CMV和pAdEasy-1共转染293细胞，成功构建的重组腺病毒Ad-SFRP2，确定转染效率。原代培养增生性瘢痕成纤维细胞，利用Ad-SFRP2感染该细胞。通过RT-PCR和Western Blot分别检测感染后人瘢痕成纤维细胞及对照组细胞中SFRP2基因mRNA和蛋白表达水平。结果：RT-PCR检测结果显示腺病毒Ad-SFRP2的PCR产物约为904bp，SFRP2 mRNA表达水平明显增高；用抗SFRP2多克隆抗体进行Western blot检测为阳性，感染的重组腺病毒载体在人瘢痕成纤维细胞中SFRP2蛋白有较高的稳定表达。结论：成功构建含有人SFRP2基因的重组腺病毒Ad-SFRP2；它可有效提高人增生性瘢痕成纤维细胞中SFRP2基因的表达水平。
[关键词]SFRP2；腺病毒；增生性瘢痕；成纤维细胞
[中图分类号]R318 [文献标识码] [文章编号]1008-6455(2012)11-1981-04
成纤维细胞作为创伤愈合时的主要效应细胞，在包含增生性瘢痕和瘢痕疙瘩在内诸多以过度增生为特征的病变中，常常表现为凋亡抑制，进而引发一系列连锁反应造成创面修复失控并最终导致过度纤维化而形成增生性瘢痕[1]。我们过去运用从基因芯片中筛选出一个具有抑制细胞凋亡作用、在早期增生性瘢痕中呈显著高表达的基因SFRP2[2-3]，该基因可能在增生性瘢痕形成的过程中起着重要作用。但是目前SFRP2调控增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的分子机制尚不明了，有必要进行进一步研究。
本实验利用pAd-Easy腺病毒载体系统[4]，通过PCR扩增SFRP2基因，克隆到腺病毒载体pAdEasy共转染293细胞，构建携带SFRP2基因的重组腺病毒，在体外感染人增生性瘢痕成纤维细胞以观察SFRP2基因表达情况，为进一步研究该基因的功能奠定理论和实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料：pGBKT-SFRP2质粒(袁顺宗博士惠赠)。感受态菌株及293细胞株(我院烧伤研究所)；RPMI-1640培养基、胎牛血清(美国Haclon公司)。限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、T4DNA聚合酶、pMD18-T载体、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000(Takara公司)。Lipofectamine2000(Invitrogen公司)。Trizol及RT-PCR试剂(美国Invitrogen公司)。逆转录试剂盒(美国Fermentas公司)。兔抗人SFRP2多克隆抗体(美国CST公司)。
1.2 方法
1.2.1 增生性瘢痕成纤维细胞的分离培养：采用组织块法[6]进行增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养，具体方法如下：将手术中取下的增生性瘢痕标本仔细切除皮下脂肪组织和表皮，用加有青霉素和链霉素的消毒蒸馏水洗涤3次，再用消毒生理盐水漂洗3次；在少量含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中用锋利的刀片将组织切割成约1mm大小的块，并接种于25ml的培养瓶中，置于37℃，5% CO2的孵箱中培养，待长成致密层以后，用2.5g/L的胰蛋白酶消化传代，实验所用的是第3～6代的细胞。
1.2.2 SFRP2编码序列的扩增：采用Primer5.0软件设计扩增人SFRP2基因氨基酸区域编码序列的特异性引物，并在引物5'端引入保护性碱基和限制性酶切位点，其中，上游引物序列为：5'-GAAGATCT ATGCTGCAGGGCCCTGGC-3'，下游引物序列为：5'-TTGTCGAC CTAGCACTGCAGCTTGCGGATG-3'(画线部分分别为BglII和SalI酶切位点)。以pGBKT-SFRP2质粒为模板进行PCR扩增，扩增体系组成为：5μl 10×PCR缓冲液、1μl 10mmol/L dNTPs、pGEX-IL-24重组质粒模板2μl、10μmol/L引物各1μl及DNA聚合酶1μl，用双蒸水补足至50μl。扩增程序为：94℃变性5 min，然后用逐步程序94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min完成30个循环，最后72℃延伸7 min。
1.2.3 SFRP2重组腺病毒表达载体的构建：2%琼脂糖凝胶回收SFRP2扩增产物，与pMD19-T载体连接并转化到DH5α菌中，蓝白斑初步筛选，挑取单菌落提粒，BglII和SalI双酶切及PCR鉴定，鉴定正确的质粒经BglII和SalI双酶切 ......
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