复方中药软膏在猪断层皮创面愈合中的作用研究(2)
Key words：Duroc pig；wound repair；TGF-β；catalase；MDA
创面愈合是指外伤或其他疾病过程中，造成组织缺损后局部组织通过增生或再生方式进行修补的一系列复杂的病理生理过程[1]。断层皮创面愈合模型是利用取皮刀或取皮鼓切取一定厚度的皮肤，形成创面供修复研究之用，与治疗烧伤创面取皮的供皮区一致，其特点是创面大小与深度可以人为控制[2]。外用中药对创面愈合的作用是多方面、多环节的，是一个复杂的过程。本文对复方中药软膏能否促进猪皮肤创伤创面的愈合进行了初步研究。
1 材料和方法
1.1. 实验用动物及试剂：实验用4月龄美国杜洛克小型白猪，体重为30～35kg，8头猪均健康，雌雄不限，由河南科技大学实验动物中心提供。复方中药软膏由大黄50～200g，地榆50～200g，黄连50～200g，丹皮30～120g，五倍子50～200g，三七15～60g，赤石脂50～200g，炉甘石50～200g，乳香10～40g，没药10～40g，蜂蜡50～200g，冰片10～40g，麻油1000～4000g等组成，此配方由河南科技大学医学技术与工程学院提供。斯丽凯纳米银抗菌凝胶(深圳市源兴纳米医药科技有限公司，生产批号：111104008)。SOD及MDA试剂盒由( 南京建成生物工程研究所)， 猪转化生长因子β测试盒(上海科兴商贸公司提供，源自美国R&D公司)，氯胺酮注射液(福建古田药业有限公司，规格0.1g，产品批号：110302)。
1.2 实验用器材：WFJ7200型可见光分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。酶标仪(型号ELX800，美国伯腾仪器有限公司)， 数码照相机(尼康S8200)，取皮鼓(上海手术器械六厂)，数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)，旋涡振荡器QL-901(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，离心机 Anke TGL-16C(上海安亭科学仪器厂)，电子天平FA1004(上海良平仪器仪表有限公司)，电热恒温培养箱(DHP-9082型，上海恒科学仪器有限公司)
2 方法
2.1 创伤模型的制作：实验前1天背部脊柱两侧备皮， 实验当天用氯胺酮注射液肌肉注射全身麻醉，剂量为10mg/kg，麻醉后用取皮鼓调整刻度后，在猪背部两侧切取实验所设计大小及深度的皮肤，用游标卡尺再次测量所切掉皮肤深度平均为1.2mm，达部分真皮层。每个创面大小为6cm×10cm，每个创面间距为8cm(见图1、2)。
2.2 致伤面积百分比和致伤深度：猪创伤面积/猪TBSA=S1/S。 S1=360㎝2，S=KW2/3 为动物总体表面积计算公式单位为㎝2，K为系数9.0，W为体重单位g。计算出创伤面积比S1/S=3.74%～4.14%。 预实验切取4月龄左右猪正常皮肤做病理切片，并在显微镜下测定表皮厚度在50～75μm，真皮厚度在1150～1350μm，表皮与真皮总厚度在1250～1480μm。现调节取皮鼓刻度，使致伤深度达真皮厚度3/4，约1200μm。
2.3 实验动物分组：每头猪6个创面，2个创面为一组，随机分三组，即复方中药软膏组(A组)、斯丽凯组(B组)及空白对照组(C组)。共8头猪48个创面。创面制作完成后采用固定吊养。(见图3、4)
2.4 创面用药：创面模型制作后，每组创面各进行定量给药，用药量电子天平称量后约为1.0g，均匀涂抹创面，每天换药一次，空白对照组每天碘伏擦洗，并用无菌纱布覆盖创面。
2.5 创面取材：每隔4天在每只猪固定创面用环钻取1cm×1cm组织，取材后进行组织粉碎，然后测试组织中转化生长因子β含量，SOD及MDA含量。创伤后每隔7天用环钻取材，用10%甲醛进行固定。取材后区域不计入愈合率。
2.6 创面检测指标
2.6.1 创面大体观察：伤后每天对创面一般情况观察，在创面完全上皮化时计算创面愈合时间。创面完全上皮化所需要的时间， 而上皮化依靠的肉眼观察确定[3]。
2.6.2 创面组织学观察：切取组织用10%甲醛保存固定做HE染色，观察表皮与真皮情况。
2.6.3 检测各组创面皮肤组织中TGF-β含量、SOD含量、MDA含量： 应用化学比色法测定上述三种含量。TGF-β含量按测试盒说明书检测，过程如下：标准品的稀释→加样→温育→配液→洗涤→加酶→温育→洗涤→显色→终止→测定。SOD含量按南京建成测试盒说明书检测，过程如下：样本前处理→操作表操作→计算公式计算数值等。MDA含量按南京建成测试盒说明书检测，过程如下：样本前处理→操作表操作→组织中MDA含量计算公式计算数值等。
2.7 统计学分析：用SPSS17.0软件实验数据均以x±s表示， 差异显著性分析采用方差分析和多重比较。检验水准a=0.05，P>0.05差异无统计学意义；P<0.05差异有统计学意义。
3 结果
3.1 一般状况：整个实验过程，实验动物营养状态良好，饮食睡眠均正常，未出现动物死亡现象。其中一头猪出现轻度脱肛现象，经处理后未再脱肛(图1～4)。
3.2 断层皮厚度测量：创面断层皮厚度统计数据显示为(1201.55±10.95)μm，断层皮厚度测量见(图24)。
3.3 猪皮肤创面镜下HE染色观察：复方中药软膏组(A组)、斯丽凯组(B组)、空白对照组(C)，第5、第9、第14、第19、第24、第29天创面组织镜下观察(200×)。镜下可见复方中药组表皮结构形成较斯丽凯及空白组快，胶原纤维排列紧密，结果见图5～23。
3.4 各组创面愈合时间以及各组创面中TGF-β、SOD、MDA含量比较：见表1～4。从各组创面愈合时间显示，中药组所用时间为(13.17±1.75)天，空白组时间为(24.67±2.64)天见(表2)，三组之间两两比较均为 P<0.05，差异具有统计学意义。 (史迅等)
创面愈合是指外伤或其他疾病过程中，造成组织缺损后局部组织通过增生或再生方式进行修补的一系列复杂的病理生理过程[1]。断层皮创面愈合模型是利用取皮刀或取皮鼓切取一定厚度的皮肤，形成创面供修复研究之用，与治疗烧伤创面取皮的供皮区一致，其特点是创面大小与深度可以人为控制[2]。外用中药对创面愈合的作用是多方面、多环节的，是一个复杂的过程。本文对复方中药软膏能否促进猪皮肤创伤创面的愈合进行了初步研究。
1 材料和方法
1.1. 实验用动物及试剂：实验用4月龄美国杜洛克小型白猪，体重为30～35kg，8头猪均健康，雌雄不限，由河南科技大学实验动物中心提供。复方中药软膏由大黄50～200g，地榆50～200g，黄连50～200g，丹皮30～120g，五倍子50～200g，三七15～60g，赤石脂50～200g，炉甘石50～200g，乳香10～40g，没药10～40g，蜂蜡50～200g，冰片10～40g，麻油1000～4000g等组成，此配方由河南科技大学医学技术与工程学院提供。斯丽凯纳米银抗菌凝胶(深圳市源兴纳米医药科技有限公司，生产批号：111104008)。SOD及MDA试剂盒由( 南京建成生物工程研究所)， 猪转化生长因子β测试盒(上海科兴商贸公司提供，源自美国R&D公司)，氯胺酮注射液(福建古田药业有限公司，规格0.1g，产品批号：110302)。
1.2 实验用器材：WFJ7200型可见光分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。酶标仪(型号ELX800，美国伯腾仪器有限公司)， 数码照相机(尼康S8200)，取皮鼓(上海手术器械六厂)，数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)，旋涡振荡器QL-901(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，离心机 Anke TGL-16C(上海安亭科学仪器厂)，电子天平FA1004(上海良平仪器仪表有限公司)，电热恒温培养箱(DHP-9082型，上海恒科学仪器有限公司)
2 方法
2.1 创伤模型的制作：实验前1天背部脊柱两侧备皮， 实验当天用氯胺酮注射液肌肉注射全身麻醉，剂量为10mg/kg，麻醉后用取皮鼓调整刻度后，在猪背部两侧切取实验所设计大小及深度的皮肤，用游标卡尺再次测量所切掉皮肤深度平均为1.2mm，达部分真皮层。每个创面大小为6cm×10cm，每个创面间距为8cm(见图1、2)。
2.2 致伤面积百分比和致伤深度：猪创伤面积/猪TBSA=S1/S。 S1=360㎝2，S=KW2/3 为动物总体表面积计算公式单位为㎝2，K为系数9.0，W为体重单位g。计算出创伤面积比S1/S=3.74%～4.14%。 预实验切取4月龄左右猪正常皮肤做病理切片，并在显微镜下测定表皮厚度在50～75μm，真皮厚度在1150～1350μm，表皮与真皮总厚度在1250～1480μm。现调节取皮鼓刻度，使致伤深度达真皮厚度3/4，约1200μm。
2.3 实验动物分组：每头猪6个创面，2个创面为一组，随机分三组，即复方中药软膏组(A组)、斯丽凯组(B组)及空白对照组(C组)。共8头猪48个创面。创面制作完成后采用固定吊养。(见图3、4)
2.4 创面用药：创面模型制作后，每组创面各进行定量给药，用药量电子天平称量后约为1.0g，均匀涂抹创面，每天换药一次，空白对照组每天碘伏擦洗，并用无菌纱布覆盖创面。
2.5 创面取材：每隔4天在每只猪固定创面用环钻取1cm×1cm组织，取材后进行组织粉碎，然后测试组织中转化生长因子β含量，SOD及MDA含量。创伤后每隔7天用环钻取材，用10%甲醛进行固定。取材后区域不计入愈合率。
2.6 创面检测指标
2.6.1 创面大体观察：伤后每天对创面一般情况观察，在创面完全上皮化时计算创面愈合时间。创面完全上皮化所需要的时间， 而上皮化依靠的肉眼观察确定[3]。
2.6.2 创面组织学观察：切取组织用10%甲醛保存固定做HE染色，观察表皮与真皮情况。
2.6.3 检测各组创面皮肤组织中TGF-β含量、SOD含量、MDA含量： 应用化学比色法测定上述三种含量。TGF-β含量按测试盒说明书检测，过程如下：标准品的稀释→加样→温育→配液→洗涤→加酶→温育→洗涤→显色→终止→测定。SOD含量按南京建成测试盒说明书检测，过程如下：样本前处理→操作表操作→计算公式计算数值等。MDA含量按南京建成测试盒说明书检测，过程如下：样本前处理→操作表操作→组织中MDA含量计算公式计算数值等。
2.7 统计学分析：用SPSS17.0软件实验数据均以x±s表示， 差异显著性分析采用方差分析和多重比较。检验水准a=0.05，P>0.05差异无统计学意义；P<0.05差异有统计学意义。
3 结果
3.1 一般状况：整个实验过程，实验动物营养状态良好，饮食睡眠均正常，未出现动物死亡现象。其中一头猪出现轻度脱肛现象，经处理后未再脱肛(图1～4)。
3.2 断层皮厚度测量：创面断层皮厚度统计数据显示为(1201.55±10.95)μm，断层皮厚度测量见(图24)。
3.3 猪皮肤创面镜下HE染色观察：复方中药软膏组(A组)、斯丽凯组(B组)、空白对照组(C)，第5、第9、第14、第19、第24、第29天创面组织镜下观察(200×)。镜下可见复方中药组表皮结构形成较斯丽凯及空白组快，胶原纤维排列紧密，结果见图5～23。
3.4 各组创面愈合时间以及各组创面中TGF-β、SOD、MDA含量比较：见表1～4。从各组创面愈合时间显示，中药组所用时间为(13.17±1.75)天，空白组时间为(24.67±2.64)天见(表2)，三组之间两两比较均为 P<0.05，差异具有统计学意义。 (史迅等)