人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究(3)
2 结果
2.1 细胞培养如图1～2。
2.2细胞表面标记物：经流式细胞仪检测，ADSCs 均一表达CD29、CD90、CD105，阳性率分别为73.4%、97.3%和80.4%。
2.3油红O染色鉴定 ADSCs 向脂肪细胞定向分化：
诱导1周后可见细胞内有大小不一的脂滴形成，油红O染色后可见脂滴被染成橙红色(如图3)。
2.4 HaCat-EGF 细胞中 EGF 分泌量：经 ELISA 试剂盒检测，转染 EGF 的 HaCat 细胞24、48、72h EGF的分泌量分别为：492、622、943ng/L(如图4)。
2.5 SYBR Green实时荧光定量 PCR 检测 ADSCs mRNA 水平(如图5)。
3 讨论
ADSCs 凭借其来源丰富、取材容易、对机体损伤小、体外增殖迅速、生物学性状稳定等优点，已成为细胞移植及组织工程理想的种子细胞，是人体干细胞库潜在的重要来源。本实验从外科手术中剩余的腹部皮下脂肪组织为来源，采用胶原酶消化法及 DMEM培养法分离得到细胞。目前，CD29、CD90、CD105被公认为具有多向分化潜能细胞的标记分子，而造血细胞及内皮细胞的标记分子，如 CD34 在ADSCs 中是否表达却存在争议。在本实验中，ADSCs 经流式细胞仪分析证实CD29、CD90、CD105 表达为阳性。干细胞与终末分化细胞的不同之处不仅在于细胞表面标记分子表达情况不同，而且前者具有多向分化的能力，因此鉴定 ADSCs 最好的方法是进行多向分化诱导并进行相应检测以确定诱导成功。故本实验采用成脂诱导分化实验对培养细胞的干细胞特性进行鉴定。
本实验利用pcDNA3.1(+)/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的HaCat细胞与ADSCs共培养，通过转染EGF的HaCat 细胞分泌EGF，以及HaCat细胞分泌的其他细胞因子作用于ADSCs，使 ADSCs向表皮细胞表型转化。构建的EGF基因表达载体不但可以经体外培养及活体途径转入人角质形成细胞，同时可借助外分泌机制参与对邻近细胞的生长调控。CK19、integrin-β被认为是表皮干细胞的重要标记物[11-12]。研究表明，缺少integrin-β 会严重影响表皮的分化和形成，其介导表皮干细胞与细胞外基质的粘附，还调控终末分化的启动[13]。因此，本研究选择CK19、integrin-β 作为检测 ADSCs 分化的指标。
本实验成功诱导了ADSCs向表皮细胞表型的定向分化，对临床上解决大面积烧伤、严重创伤病人的皮源紧缺以及促进创面修复等问题提供了新的探索途径，为ADSCs成为表皮组织工程学研究的理想种子细胞奠定了基础。
[参考文献]
[1]Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al. Multilineage cells from human adipose tissue：implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng，2001，7(2)：211-228.
[2]Winter A，Breit S，Parsch D，et al. Cartilage-like gene expression in differentiated human stem cell spheriods： a comparison of bone marrow-derived and adipose tissue-derived stromal cells[J]. Arthritis Rheum，2003，48(2)：418-429.
[3]Safford KM，Hicok KC，Safford SD，et al. Neuogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2002，294(2)： 371-379.
[4]Rangappa S，Fen C，Lee EH，et al. Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes[J].Ann Thorac Surg，2003，75(3)：775-779.
[5]Lu F，Mizuno H，Uysal CA，et al.Improved viability of random pattern skin flaps through the use of adipose-derived stem cells[J].Plast Reconstr Surg，2008，121(1)： 50-58.
[6]Ramos TV，Wang T，Maki CB，et al.Adipose stem cell side population in the mouse[J].J Tissue Eng Regen Med，2009，3(6)：430-441.
[7]Derby BM，Dai H，Reichensperger J，et al. Adipose-derived stem cell to epithelial stem cell transdifferentiation： a mechanism to potentially improve understanding of fat grafting's impact on skin rejuvenation[J]. Aesthet Surg J，2014，34(1)：142-153. (赵周婷等)
2.1 细胞培养如图1～2。
2.2细胞表面标记物：经流式细胞仪检测，ADSCs 均一表达CD29、CD90、CD105，阳性率分别为73.4%、97.3%和80.4%。
2.3油红O染色鉴定 ADSCs 向脂肪细胞定向分化：
诱导1周后可见细胞内有大小不一的脂滴形成，油红O染色后可见脂滴被染成橙红色(如图3)。
2.4 HaCat-EGF 细胞中 EGF 分泌量：经 ELISA 试剂盒检测，转染 EGF 的 HaCat 细胞24、48、72h EGF的分泌量分别为：492、622、943ng/L(如图4)。
2.5 SYBR Green实时荧光定量 PCR 检测 ADSCs mRNA 水平(如图5)。
3 讨论
ADSCs 凭借其来源丰富、取材容易、对机体损伤小、体外增殖迅速、生物学性状稳定等优点，已成为细胞移植及组织工程理想的种子细胞，是人体干细胞库潜在的重要来源。本实验从外科手术中剩余的腹部皮下脂肪组织为来源，采用胶原酶消化法及 DMEM培养法分离得到细胞。目前，CD29、CD90、CD105被公认为具有多向分化潜能细胞的标记分子，而造血细胞及内皮细胞的标记分子，如 CD34 在ADSCs 中是否表达却存在争议。在本实验中，ADSCs 经流式细胞仪分析证实CD29、CD90、CD105 表达为阳性。干细胞与终末分化细胞的不同之处不仅在于细胞表面标记分子表达情况不同，而且前者具有多向分化的能力，因此鉴定 ADSCs 最好的方法是进行多向分化诱导并进行相应检测以确定诱导成功。故本实验采用成脂诱导分化实验对培养细胞的干细胞特性进行鉴定。
本实验利用pcDNA3.1(+)/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的HaCat细胞与ADSCs共培养，通过转染EGF的HaCat 细胞分泌EGF，以及HaCat细胞分泌的其他细胞因子作用于ADSCs，使 ADSCs向表皮细胞表型转化。构建的EGF基因表达载体不但可以经体外培养及活体途径转入人角质形成细胞，同时可借助外分泌机制参与对邻近细胞的生长调控。CK19、integrin-β被认为是表皮干细胞的重要标记物[11-12]。研究表明，缺少integrin-β 会严重影响表皮的分化和形成，其介导表皮干细胞与细胞外基质的粘附，还调控终末分化的启动[13]。因此，本研究选择CK19、integrin-β 作为检测 ADSCs 分化的指标。
本实验成功诱导了ADSCs向表皮细胞表型的定向分化，对临床上解决大面积烧伤、严重创伤病人的皮源紧缺以及促进创面修复等问题提供了新的探索途径，为ADSCs成为表皮组织工程学研究的理想种子细胞奠定了基础。
[参考文献]
[1]Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al. Multilineage cells from human adipose tissue：implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng，2001，7(2)：211-228.
[2]Winter A，Breit S，Parsch D，et al. Cartilage-like gene expression in differentiated human stem cell spheriods： a comparison of bone marrow-derived and adipose tissue-derived stromal cells[J]. Arthritis Rheum，2003，48(2)：418-429.
[3]Safford KM，Hicok KC，Safford SD，et al. Neuogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2002，294(2)： 371-379.
[4]Rangappa S，Fen C，Lee EH，et al. Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes[J].Ann Thorac Surg，2003，75(3)：775-779.
[5]Lu F，Mizuno H，Uysal CA，et al.Improved viability of random pattern skin flaps through the use of adipose-derived stem cells[J].Plast Reconstr Surg，2008，121(1)： 50-58.
[6]Ramos TV，Wang T，Maki CB，et al.Adipose stem cell side population in the mouse[J].J Tissue Eng Regen Med，2009，3(6)：430-441.
[7]Derby BM，Dai H，Reichensperger J，et al. Adipose-derived stem cell to epithelial stem cell transdifferentiation： a mechanism to potentially improve understanding of fat grafting's impact on skin rejuvenation[J]. Aesthet Surg J，2014，34(1)：142-153. (赵周婷等)