小鼠胚胎成纤维细胞滋养层对小鼠诱导多能干细胞的作用研究(2)
1 材料和方法
1.1 小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)分离培养：取E12.5～14.5d ICR孕鼠，断颈处死，于超净台内无菌条件下暴露子宫。用显微镊取出整个子宫，用PBS冲洗三次，弃除表面残余血迹。沿子宫系膜侧剪开子宫，取出胚胎，置于有PBS的平皿内，充分洗涤，弃除表面红细胞。剥除胎膜，取出胎鼠，用PBS洗涤三次。用眼科剪剪除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部用PBS洗涤三次，充分弃除红细胞。再将鼠胚躯干剪成1mm3以下的碎块， 吸置于离心管内，加入0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化10min。然后加入足量培养液终止消化。在4℃条件下，1000r/min，离心5min。弃掉上清，加适量培养液(DMEM+10%FBS)，反复吹打20次，接种到培养瓶中，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养。待细胞互相重叠爬满整个培养瓶底时即可传代。
1.2 灭活MEFs制备滋养层：培养的MEFs中加入10μg/ml丝裂霉素C混匀。置培养箱中3h。吸弃废液，用PBS(不含钙镁)冲洗5～6次 ......
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1.1 小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)分离培养：取E12.5～14.5d ICR孕鼠，断颈处死，于超净台内无菌条件下暴露子宫。用显微镊取出整个子宫，用PBS冲洗三次，弃除表面残余血迹。沿子宫系膜侧剪开子宫，取出胚胎，置于有PBS的平皿内，充分洗涤，弃除表面红细胞。剥除胎膜，取出胎鼠，用PBS洗涤三次。用眼科剪剪除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部用PBS洗涤三次，充分弃除红细胞。再将鼠胚躯干剪成1mm3以下的碎块， 吸置于离心管内，加入0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化10min。然后加入足量培养液终止消化。在4℃条件下，1000r/min，离心5min。弃掉上清，加适量培养液(DMEM+10%FBS)，反复吹打20次，接种到培养瓶中，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养。待细胞互相重叠爬满整个培养瓶底时即可传代。
1.2 灭活MEFs制备滋养层：培养的MEFs中加入10μg/ml丝裂霉素C混匀。置培养箱中3h。吸弃废液，用PBS(不含钙镁)冲洗5～6次 ......
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