去铁胺促进血管内皮祖细胞靶向归巢和血管化的实验研究(2)
Key words： hypoxia mimetic agent； HIF-1； EPCs； homing； neovascularization； PI3K/AKT signaling pathway
血管新生过程在缺血性疾病中起重要作用，大量的动物实验证明移植EPCs可以改善缺血组织的血管新生过程[1]。但是最近研究表明外源性EPCs移植后向损伤处的迁移和停留数量较低[2]，这表明单纯性的移植EPCs对缺血组织的治疗作用不充分。2004年Ceradini发现祖细胞向损伤处的招募是通过HIF-1(Hypoxia Inducible Factor-1，低氧诱导因子1)诱导的SDF-1(Stromal Cell Derived Factor-1，基质细胞衍生因子1)表达，受氧梯度调节[3]。缺氧环境是重要的刺激因素，可以激活HIF-1α，调节下游的SDF-1和VEGF的表达[4-5]，从而进一步调节细胞功能和组织对缺氧环境的回应。SDF-1和受体CXCR4被证明可以促进EPCs招募、增殖，并且调节干细胞的迁移，加速缺血组织的血管化过程[3，6]。
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铁螯合剂DFO用于治疗铁过量等疾病，可以抑制脯氨酰羟化酶的活性，从而稳定HIF-1α的表达[7]，在实验中常作为低氧模拟剂。最近的动物实验研究表明DFO可以加速缺血组织的血管化[8-9]。本实验应用DFO模拟组织缺氧环境，研究DFO是否可以促进EPCs向缺血缺氧区域的迁移归巢，从而促进缺血组织的血管化，同时研究该过程的机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器：3周龄荧光素酶转基因Lewis雄性大鼠5只，由日本Jichi医学院提供。8周龄雄性NOD/SCID裸鼠50只，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。淋巴细胞分离液(Sigma-Aldrich，美国)，Mouse Anti-CD34(Santa Cruze，美国)，Rabbit Anti-CD133(Abcam，美国)，Mouse Anti-CD31(Dako，美国)，Mouse Anti-KDR(Abcam，美国)，Goat Anti-rabbit 488(Invitrogen，美国)，Goat Anti-mouse 488(Invitrogen，美国)，Goat Anti-rabbit 555(Invitrogen，美国)，Goat Anti-mouse555(Invitrogen，美国)，Rabbit Anti-α-SMA(Abcam，美国)，Rabbit Anti-Luciferase(Abcam，美国)，荧光素酶底物(Promega，美国)，CO2培养箱(Beckman，美国)，流式细胞仪(BD，德国)，恒倒置相差显微镜(Nikon，日本)，荧光显微镜(Nikon，日本)，IVIS Imaging System(Xenogen，美国)，激光散斑成像(Moor Instrument，英国)。
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1.2 细胞分离、培养及鉴定
1.2.1 EPCs的分离与培养：3周龄雄性luciferase转基因Lewis大鼠，用10%水合氯醛过量麻醉处死。分离出股骨、胫骨和肱骨，用冷PBS冲出骨髓，然后用PBS将细胞洗涤3次。15ml离心管底部加入3ml淋巴细胞分离液，上层加入骨髓细胞混悬液，用密度梯度离心法分离细胞，PBS洗涤3次。在收集的单个核细胞中加入CD34单克隆抗体10μl， 混匀后4℃孵育30min；工作液(PBS+5%胎牛血清)重悬，1 500r/min离心5min，共离心2次；收集细胞，加入100μl工作液，加入磁珠二抗10μl，摇匀后4℃孵育30min；通过MACS磁性分离柱，获取CD34+细胞；EGM-2MV重悬，调整细胞浓度至107/ml，接种于直径10cm的培养皿内，37℃、5% CO2培养箱内培养；原代细胞3d换液，去除未贴壁的细胞，待细胞长满后传代培养。
1.2.2 摄取DiI-Ac-LDL(荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白)试验：将分离培养3d的CD34+细胞接种于盖玻片上；细胞爬片约有60%融合率时取出爬片，PBS漂洗5min，共3次；加入10μg/ml的DiI-Ac-LDL，37℃避光孵育3h；荧光显微镜观察，计数染色阳性的细胞比例。
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1.2.3 流式分析细胞表面标记物变化：将细胞(2×105)与稀释的抗体混合，包括CD34(1：100)，CD133(1：200)和KDR(1：200)抗体，置于4℃，孵化30min；以1 500r/min离心5min，清洗2次，弃上清，PBS重悬；加入二抗孵化30min，稀释比例1：500，PBS重悬，以1 500r/min离心5min，清洗2次；流式细胞仪检测，并用FCS Express 4软件分析结果。
1.3 动物模型制备、细胞移植及实验分组
1.3.1 动物模型制备：裸鼠下肢缺血手术模型参考以前的报道制备[10]。
1.3.2 EPCs移植：将裸鼠按体重以0.5mg/g戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉；在左大腿中间处纵行切开皮肤，暴露并分离股动、静脉，在股动脉的近端用10-0的尼龙线结扎；用带有29G针头的1ml注射器从股动脉近端刺入，将2×105(总量200μl)个细胞通过股动脉注射进入全身循环；迅速用10-0尼龙线结扎股动脉的远端，剔除此段股动脉；7-0尼龙线缝合皮肤，将裸鼠放回笼内饲养。
1.3.3 实验分组：将实验动物随机分成5组，每组10只，观察14d：①对照组：PBS组；②EPCs组：移植2×105个EPCs；③EPCs-DFO组：移植2×105个EPCs，术后每日腹腔注射DFO 100mg/kg/d；④EPCs-DFO-AMD组：移植2×105个EPCs，术后每日腹腔注射DFO 100mg/kg/d，AMD3100 10mg/kg/d；⑤EPCs-DFO-LY组：移植2×105个EPCs，術后每日腹腔注射DFO 100mg/kg/d，LY294002 20mg/kg/d。, 百拇医药(郑胜武 黄雄梅 庄兢 林根辉 杨宇 丁昕)
血管新生过程在缺血性疾病中起重要作用，大量的动物实验证明移植EPCs可以改善缺血组织的血管新生过程[1]。但是最近研究表明外源性EPCs移植后向损伤处的迁移和停留数量较低[2]，这表明单纯性的移植EPCs对缺血组织的治疗作用不充分。2004年Ceradini发现祖细胞向损伤处的招募是通过HIF-1(Hypoxia Inducible Factor-1，低氧诱导因子1)诱导的SDF-1(Stromal Cell Derived Factor-1，基质细胞衍生因子1)表达，受氧梯度调节[3]。缺氧环境是重要的刺激因素，可以激活HIF-1α，调节下游的SDF-1和VEGF的表达[4-5]，从而进一步调节细胞功能和组织对缺氧环境的回应。SDF-1和受体CXCR4被证明可以促进EPCs招募、增殖，并且调节干细胞的迁移，加速缺血组织的血管化过程[3，6]。
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铁螯合剂DFO用于治疗铁过量等疾病，可以抑制脯氨酰羟化酶的活性，从而稳定HIF-1α的表达[7]，在实验中常作为低氧模拟剂。最近的动物实验研究表明DFO可以加速缺血组织的血管化[8-9]。本实验应用DFO模拟组织缺氧环境，研究DFO是否可以促进EPCs向缺血缺氧区域的迁移归巢，从而促进缺血组织的血管化，同时研究该过程的机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器：3周龄荧光素酶转基因Lewis雄性大鼠5只，由日本Jichi医学院提供。8周龄雄性NOD/SCID裸鼠50只，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。淋巴细胞分离液(Sigma-Aldrich，美国)，Mouse Anti-CD34(Santa Cruze，美国)，Rabbit Anti-CD133(Abcam，美国)，Mouse Anti-CD31(Dako，美国)，Mouse Anti-KDR(Abcam，美国)，Goat Anti-rabbit 488(Invitrogen，美国)，Goat Anti-mouse 488(Invitrogen，美国)，Goat Anti-rabbit 555(Invitrogen，美国)，Goat Anti-mouse555(Invitrogen，美国)，Rabbit Anti-α-SMA(Abcam，美国)，Rabbit Anti-Luciferase(Abcam，美国)，荧光素酶底物(Promega，美国)，CO2培养箱(Beckman，美国)，流式细胞仪(BD，德国)，恒倒置相差显微镜(Nikon，日本)，荧光显微镜(Nikon，日本)，IVIS Imaging System(Xenogen，美国)，激光散斑成像(Moor Instrument，英国)。
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1.2 细胞分离、培养及鉴定
1.2.1 EPCs的分离与培养：3周龄雄性luciferase转基因Lewis大鼠，用10%水合氯醛过量麻醉处死。分离出股骨、胫骨和肱骨，用冷PBS冲出骨髓，然后用PBS将细胞洗涤3次。15ml离心管底部加入3ml淋巴细胞分离液，上层加入骨髓细胞混悬液，用密度梯度离心法分离细胞，PBS洗涤3次。在收集的单个核细胞中加入CD34单克隆抗体10μl， 混匀后4℃孵育30min；工作液(PBS+5%胎牛血清)重悬，1 500r/min离心5min，共离心2次；收集细胞，加入100μl工作液，加入磁珠二抗10μl，摇匀后4℃孵育30min；通过MACS磁性分离柱，获取CD34+细胞；EGM-2MV重悬，调整细胞浓度至107/ml，接种于直径10cm的培养皿内，37℃、5% CO2培养箱内培养；原代细胞3d换液，去除未贴壁的细胞，待细胞长满后传代培养。
1.2.2 摄取DiI-Ac-LDL(荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白)试验：将分离培养3d的CD34+细胞接种于盖玻片上；细胞爬片约有60%融合率时取出爬片，PBS漂洗5min，共3次；加入10μg/ml的DiI-Ac-LDL，37℃避光孵育3h；荧光显微镜观察，计数染色阳性的细胞比例。
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1.2.3 流式分析细胞表面标记物变化：将细胞(2×105)与稀释的抗体混合，包括CD34(1：100)，CD133(1：200)和KDR(1：200)抗体，置于4℃，孵化30min；以1 500r/min离心5min，清洗2次，弃上清，PBS重悬；加入二抗孵化30min，稀释比例1：500，PBS重悬，以1 500r/min离心5min，清洗2次；流式细胞仪检测，并用FCS Express 4软件分析结果。
1.3 动物模型制备、细胞移植及实验分组
1.3.1 动物模型制备：裸鼠下肢缺血手术模型参考以前的报道制备[10]。
1.3.2 EPCs移植：将裸鼠按体重以0.5mg/g戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉；在左大腿中间处纵行切开皮肤，暴露并分离股动、静脉，在股动脉的近端用10-0的尼龙线结扎；用带有29G针头的1ml注射器从股动脉近端刺入，将2×105(总量200μl)个细胞通过股动脉注射进入全身循环；迅速用10-0尼龙线结扎股动脉的远端，剔除此段股动脉；7-0尼龙线缝合皮肤，将裸鼠放回笼内饲养。
1.3.3 实验分组：将实验动物随机分成5组，每组10只，观察14d：①对照组：PBS组；②EPCs组：移植2×105个EPCs；③EPCs-DFO组：移植2×105个EPCs，术后每日腹腔注射DFO 100mg/kg/d；④EPCs-DFO-AMD组：移植2×105个EPCs，术后每日腹腔注射DFO 100mg/kg/d，AMD3100 10mg/kg/d；⑤EPCs-DFO-LY组：移植2×105个EPCs，術后每日腹腔注射DFO 100mg/kg/d，LY294002 20mg/kg/d。, 百拇医药(郑胜武 黄雄梅 庄兢 林根辉 杨宇 丁昕)