子宫内膜癌中前列腺素受体的表达及其生物学意义(1)
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【摘要】目的:研究前列腺素PGE2受体EP2在子宫内膜癌中的表达，探讨EP2在子宫内膜癌中的表达变化及其在子宫内膜癌的发生、发展过程是否存在非雌激素依赖的作用。方法:选取50例子宫内膜癌组织，应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，半定量研究各组中EP2的mRNA表达；采用免疫组织化学技术，测定组织中雌、孕激素受体的表达。结果:子宫内膜癌G1组、G2组、G3组均高于正常组(P<0.05)，而且随细胞分化越差，受体表达水平呈上升趋势 (P<0.001)；子宫内膜癌I期组、II期-IV期组均高于正常组(P=0.001)；在子宫内膜癌中，雌激素受体表达阴性组比阳性组的EP2表达水平显著升高(P<0.001)；而孕激素受体表达阴性组比阳性组的EP2表达水平高，但是差异无统计学意义(P>0.05)；绝经前(20例)与绝经后(30例)患者的子宫内膜癌中EP2的表达分别为0.905±0.251 和0.941±0.336，二者差异无统计学意义(P=0.684)。结论:在子宫内膜癌中EP2表达水平高于正常子宫内膜，并且随分期和分级升高有上升趋势，在雌激素表达阴性的子宫内膜癌比阳性者明显升高，提示PGE2及其受体EP2可能参与了子宫内膜癌的形成。在子宫内膜癌的形成过程中，，前列腺素及其受体EP2与非雌激素作用的子宫内膜癌形成过程存在某种联系，可能是PGE2通过EP2受体介导的信号通路的传导起作用。
【关键词】子宫内膜癌 ；EP2受体；雌激素受体ER；孕激素受体PR
【中图分类号】R737.33 【文献标识码】A 【文章编号】1008-6455(2010)11-0006-02
子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤，近年来在全球发病呈逐年上升趋势。在近年临床实践研究中可以观察到子宫内膜癌分为雌激素依赖性和非雌激素依赖性。雌激素依赖性肿瘤的雌孕激素受体(ER与PR)为阳性表达，一般分期早、分化好，治疗及预后较好；而非雌激素依赖性肿瘤则常常ER与PR为阴性表达，临床表现为分期晚、分化差、进展快、对内分泌治疗疗效不好，预后差。
研究显示，前列腺素受体(EP2)表达升高及前列腺素E2(PGE2)合成增加可诱导上皮细胞发生恶变，在子宫内膜癌中，EP2和PGE2起何种生物学作用尚未阐明。EP2的作用、其胞内信号途径，及其与介导PGE2对正常细胞和肿瘤上皮细胞起转化作用的靶基因的关系仍不清楚。
本研究通过研究受体EP2在子宫内膜癌中的表达，探讨EP2在子宫内膜癌中的表达变化与激素依赖的关系；在子宫内膜癌的发生、发展过程中是否存在非雌激素受体的作用。
1材料与方法
1.1研究对象:选取1999年7月-2002年7月间，年龄36-77岁的子宫内膜癌患者50例，根据FIGO手术病理分期：I期29例、II期7例、III期12例、IV期2例，G1级26例、G2级15例、G3级9例)，正常子宫内膜10例，术前未经放化疗及激素等内分泌治疗，术中取同一子宫内膜癌病变组织两份，一份用10%甲醛固定，石蜡包埋、切片、HE染色，并经病理医师确诊；另一份标本离体后立即放入液氮速冻4hr以上，然后保存于-70℃低温冰箱备用。
1.2实验方法
1.2.1RNA提取：取每例冻存组织标本约100mg，在4℃匀浆，参照Trizol试剂盒(Promega公司)说明书提取RNA。RNA产物在紫外分光光度计260/280处测定RNA样品的吸光度值，计算样品的纯度及浓度。取5ulRNA样品于1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外分析仪下观察结果并记录。
1.2.2引物设计[1]：内参照引物GAPDH：上游5’-CGGATTTGGTCGTATTGG-3’，下游5’GATGGCATGGACTGTGGT-3’,扩增片段长517bp;受体EP2:上游5’-CTTACCTGCAGCTGTACG-3’，下游5’-GATGGCAAAGACCCAAGG-3’，扩增片段长367bp。以上引物均由上海博雅生物技术公司合成。
1.2.3所有子宫内膜组织EP2的mRNA表达水平测定：采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，逆转录试剂均为美国Promega公司产品。逆转录反应体系25ul：5*RT缓冲液5ul，Dntp(10mM)5ul,Rnasin(50u/ul)0.5ul,随机引物(0.5ug/ul)2ul， M-MLV逆转录酶(200u/ul)1ul，样品RNA2ug，加入三蒸水至终体积25ul。反应条件：37℃水浴1 hr，95℃水浴5min灭活逆转录酶。PCR反应体系25ul：10*PCR缓冲液2.5ul，MgCl2 (25mmol/L)1.5 ul, dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L)2.0ul，目的片段上、下游引物(各25pmol/ul)各1ul， GAPDH上、下游引物(各pmol/ul)各0.5ul，样品cDNA2.0ul，Taq酶(5u/ul)0.3ul，加入三蒸水至终体积25ul。 EP2和GAPDH扩增条件： 94℃预变性1min；循环条件，95℃变性45s,60℃退火1min,72℃延伸1min,72℃后延伸5min,35个循环。PCR产物于 2%琼脂糖凝胶电泳后观察，密度扫描分析仪测定光密度值，以EP2与GAPDH的比值来评定EP2mRNA的表达水平。
1.2.4子宫内膜组织ER和PR的免疫组织化学检测：
(1)试剂：识别ER、PR的鼠抗人单抗ZM-0104和ZM-0215(购自美国Zymed公司)
(2)方法：二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，0.3%H2O2去内源性过氧化物酶，抗原修复，加入一抗4℃过夜，加入二抗37℃30min，DAB显色，苏木素复染，脱水封片。
(3)结果判定：阳性染色为棕黄色或橘黄色颗粒，多位于细胞核内。
(4)阳性对照为乳腺癌组织；阴性对照是用PBS替代一抗的替代对照。
1.3统计学方法:数据以X±SD表示 ......
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