PSA值增高患者前列腺按摩后尿液中DD3mRNA定量检测无侵入性诊断前列腺癌的意义(2)
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(2)对照组：共59例前列腺增生患者，年龄52～80岁，平均年龄6825±6.25岁。
诊断及分型标准：采用双盲设计收集标本和进行检验，以避免主观因素的影响。所有病例的诊断均以术后病理诊断结果为金标准。
1.2主要试剂和仪器:TRIzol试剂(购自Invitrogen公司)、逆转录试剂盒(MBI公司)、实时荧光PCR反应试剂盒(购自荷兰里生公司)、-80℃超低温冰箱(日本三洋)、TGL-16G-A低温高速离心机(上海安亭科学仪器厂型)、DU800紫外分光光度仪(美国Beckman公司)、Genes scan 凝胶成像扫描分析系统(荷兰QIAGEN公司)、BIO-RAD 梯度PCR扩增仪(美国ABI公司)、ABI 7000 Real-time PCR仪。
1.3标准品的制作:从阳性高表达样本中选取一个标本，根据上述步骤提取总RNA，R值为2.0，浓度为1.122ug/ul。进行RNA电泳，有清晰的285、185、5s条带。
将此RNA溶液按照1:10的比例进行梯度稀释，分为5管。从5管中分别取出lul，按照下述反转录反应步骤和条件转化为cDNA。从各管中取出2ul共5管作为制作DD3标准曲线的标准品，再分别取出2ul共5管作为制作PSA标准曲线的标准品。
1.4统计学分析：用SPSS 13.0统计软件包对数据进行统计分析，数据呈偏态分布，两样本比较用Mann-Whitney Test 秩和检验分析前列腺癌患者和前列腺增生患者DD3mRNA表达量的差异。
2结果
2.1RNA提取、RT-PCR扩增产物及结果。
2.1.1RNA质量检测结果:对所提取总RNA经分光光度计检测，其A260/A280比值均在1.8-2.1之间，经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，溴化乙锭染色，28s 18s 5s条带清晰可见，无明显降解。
2.1.2目的基因DD3mRNA的扩增结果：
图1部分样品目的基因DD3扩增曲线，扩增曲线光滑，无非特异扩增曲线
图2部分样品DD3mRNA扩增产物溶解曲线单峰、溶解温度
83℃左右，表明所扩增产物单一特异
2.2前列腺良性增生和前列腺癌病人临床检测指标,见表1。
由上表可知，两组病人的年龄比较无显著差异；前列腺体积tPSA的比较有显著性差异。
2.3运用real time RT-PCR反应进行相对定量测定的结果:PCa和BPH患者前列腺按摩后尿液DD3mRNA表达量的比较：用DD3mRNA/PSAmRNA比指表示前列腺按摩后尿液中DD3mRNA的含量。PCa组(中位数：0.267095559；范围：从0.000189129 到0541169527)与BPH组(中位数：0.001964868；范围：从0.000192014到0297394775)相比表达量显著增高，差异具有统计学意义(U=201.5，W=1971.5，Z=-6.054，P<0.05)。
3讨论
我们之前的研究发现，前列腺癌患者前列腺液中存在大量肿瘤细胞，但前列腺癌患者年龄普遍较大，前列腺液获取较为困难、前列腺癌早期脱落细胞较少，往往不能获取足够量的前列腺液或含有足够多的前列腺癌细胞的前列腺液来进行脱落细胞学检查，得出真实的结论，其临床应用受到限制。
DD3(differential display code 3)是近年来发现的位于人染色体9q21～22，全长约25kb的基因，研究发现其高度表达于人类前列腺癌细胞中,是一个具有临床潜力的前列腺癌标志物。目前认为其是一种非编码RNA基因，细胞浆中无蛋白质表达，故多在核酸水平对其进行检测分析。
本研究在建立SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法检测DD3mRNA表达的基础上，PSA增高患者前列腺按摩后尿液中的DD3mRNA的相对定量值进行了检测和对比分析，结果发现，PCa患者DD3mRNA表达量明显高于BPH患者，差异具有统计学意义(P<0.01)，与Bussemakers、陶志华在前列腺组织检验结果较为一致[5,6]。
PSA值增高的患者行前列腺按摩后尿液沉渣中DD3mRNA含量检测，较前列腺活检的损伤更小，可避免前列腺穿刺活检的风险和并发症，作为前列腺癌的一种非损伤性诊断方法具有良好的应用前景。
参考文献
[1]孙颖浩.我国前列腺癌的研究现状.中华泌尿外科杂志[J], 2004, 25(2):77-80 ......
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