α地中海贫血的研究现状
(广西贵港市人民医院产科 广西 贵港 537100)
【中图分类号】R556.7 【文献标识码】A 【文章编号】1008-6455(2011)06-0484-02
地中海贫血(thalasimia，地贫)是一组常见的常染色体隐性遗传病, 是由于α珠蛋白基因的缺失或突变功能障碍导致α珠蛋白肽链合成速率减少或不合成,造成α链和非α链合成不均衡,引起溶血性贫血[1],具有高度遗传异质性。全球约有18 亿人携带地贫基因,每年出生的各类重症地贫患儿数至少有20 万。产前筛查及超声诊断可以有效减低该病患儿的出生率。
1 发病的分子基础
α- thalasimia是具有高度异质性的单基因遗传病。编码α-珠蛋白链的基因是位于16 号染色体短臂末端的(16p13. 3-pter)α珠蛋白基因簇的成员之一。总长约29kb 包含7 个连锁的α类基因或假基因,即有2 个α基因(α1 、α2 ) ,1 个胚胎类基因(ζ2 ) ,3 个假基因(фζ1 、фα2 、фα1 ) 和1 个未知功能基因(θ) 。其中排列顺序为:5′-2-фζ1-фα2-фα1-α2-α1-θ-3′。α-Thal 主要是由于α-珠蛋白基因合成的减少或缺失所致。
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2 α地贫的基因类型
α地贫主要可以分为缺失型和非缺失型两大基因类型[2]。
2.1 缺失型α地贫-1 ：缺失从5. 2 kb 到整个基因簇不等,共有16 种类型,在中国主要是东南亚缺失型, (α-SEA占95 %;缺失型α地贫-2 ,缺失可累及1 个α基因(α1 或α2 ) 、部分α2 基因或α2 基因的5′端或α1 基因的3′端。目前已发现8 种基因型,其中最常见的两种缺失型为右缺失型(-α3. 7 ) 和左缺失型(-α4. 2 ) 。
2.2 非缺失型α地贫：指用限制性内切酶图谱法未能检出明显的基因缺失,但在其中可能包括导致基因功能丧失的小片段核苷酸的缺失、插入或碱基替代。至目前共有40 多种非缺失型α地贫被报道,在中国南方最常见的是血红蛋白Constant Spring (Hb CS) 基因突变及少量Hb Quong Sze (HbQS) 基因突变。根据基因的缺失或突变情况,临床可将α地贫分为静止型、轻型、中间型(Hb H 病) 和重型(Hb Bart′s 胎儿水肿综合征) 。
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3 α地贫的产前筛查
目前实验室诊断技术主要有筛查法和基因诊断法两种[3]。
3.1 产前筛选方法：常用筛查方法3种:血红蛋白电泳、红细胞指数、一管定量法脆性试验。目前最适当的产前筛查方法是通过血液分析仪查平均红细胞容量(MCV) 和平均红细胞血红蛋白量(MCH) 。由于红细胞储存于室温时可能会膨胀,MCH比MCV 更为可靠。以MCH < 27pg 或MCV < 80fl 为标准,基本可以完全筛查出携带者。当MCH 或MCV 小于该标准后,应进行血红蛋白电泳,若HbA2 < 2. 5 % ,则高度怀疑为α地贫基因携带者。如果发现了Hb H包涵体,则可以诊断中间型α地贫。同时还应注意血清铁蛋白测定,以排除缺铁性贫血[4]。
4 α地贫的产前诊断技术
4.1 超声诊断：是孕中期检测Bart′s水肿胎儿的简便可行方法之一。在孕12周以后,超声检测胎儿心胸比值和胎盘厚度、羊水量亦可分辩出Bart′s水肿胎儿,由于其无创伤性,简便、快速,因而超声诊断目前更易为病人所接受及乡镇卫生院的推广。
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4.2 获取胎儿标本进行产前诊断方法：包括括绒毛活检、羊水及脐血管穿刺取血检查。
绒毛活检适用于妊娠早期,一般在孕8～10 周进行,自然流产率达2 %～3 % [5] ,目前很少用于要求继续妊娠的孕妇。
羊水穿刺是目前最常用的胎儿染色体病的产前诊断方法,穿刺流产率仅为0. 1 %～0. 2 % ,羊膜腔穿刺限于妊娠16～23 周,随着产前筛查及影像技术的发展,越来越多中、晚期妊娠孕妇要求进行产前诊断。
腹部B 超引导下穿刺胎儿脐静脉穿刺获取胎儿血标本的方法，是妊娠中、晚期产前诊断的主要方法之一。与绒毛、羊水产前诊断方法比较,脐血管穿刺能够应用于妊娠中期及晚期,能更直接、快速、准确地了解胎儿有无遗传性疾病、宫内感染及血液系统疾病,可进行胎儿血液生化学检查,应用范围更为广泛。脐血管穿刺是20 世纪80 年代以后发展起来的一项具有突破性的产前诊断技术,大大提高了产前诊断成功率、准确性及产前诊断范围,但目前在国内仍未普遍开展,其原因为人们对该操作所引起的并发症的担忧。文献[56]报道结果显示脐血管穿刺导致胎儿丢失率1 % 。
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4.3 基因诊断技术:我国对地贫的基因诊断始于20世纪80年代初，先后经历了DNA点杂交、限制性内切酶酶谱分析、限制性片段长度多态性(RFL P)连锁分析、寡核苷酸(A SO)探针杂交和PCR体外基因扩增等5个发展阶段，特别是PCR及其相关发展技术，已成为最普遍的基因诊断方法。
4.3.1 缺失型α - 地贫的基因诊断：α - 地贫是世界上最早应用DNA诊断技术进行产前诊断的人类遗传病。在PCR技术诞生以前,主要采用Hb电泳,等电聚焦,高效液相色谱分析和氨基酸测序等。采用southern方法耗时,过程敏锁,不经济、且有使用同位素的诸多不便,不可能作为常规方法。但是,由于其稳定性高,有些实验室仍和其它方法结合使用。近几年,以PCR为基础的各种新方法,已广泛应用于各型α - 地贫的基因诊断。
4.3.2 非缺失型α- 地贫的基因诊断：主要采用以PCR为基础的点突变分析法来检测目的基因, PCR是利用DNA聚合酶等在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。应用血红蛋白电泳检测对血红蛋白H病能进行较好的诊断，但对标准型和静止型的α-地贫不能进行有效诊断。以PCR为基础的诊断α-地贫的方法经历了单重、双重至多重几个阶段，近年来单管多重PCR 和基因芯片技术的应用,使α地贫的三种缺失类型-α3. 7 、α4. 2及—SEA可以快捷地同时检出。应用地贫基因诊断技术对高风险胎儿进行产前基因诊断, 淘汰重型患儿是目前国际上公认的预防对策[7]。
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多重PCR它的特点是在一个PCR体系中包含4对等位基因特异引物。根据每个突变位点的特异扩增带来判断结果。在诊断各种缺失型α-地中海贫血时，相对于传统的Southern杂交技术，操作简单，周期短，不使用放射性核素，便于临床推广[8]。单管多重PCR 东南亚缺失型自身组合或与左、右缺失型相互组合可分别导致致死性的Hb Bart’s 胎儿水肿综合征和严重影响生存质量的Hb H 病。
4.3.3 基因芯片检测方法：地贫诊断基因芯片(ThalachipTM) 是一种基于DNA 芯片技术识别中国地区已知地贫基因型的新技术,专为快速检测α和β珠蛋白基因中的DNA 缺失和突变而设计,能够同时检测中国地区最常见的α3. 7 、α4. 2和-SEA三种α地贫[9] 。根据基因芯片上不同位置所出现的荧光位点颜色及强弱的变化来判断地中海贫血的基因突变类型，与传统方法比较，基因芯片诊断技术在核酸扩增的基础上，采用荧光标记及引物延伸的方法，可提高检测结果的敏感性和特异性，由于基因芯片高通量特点，可将α、β地中海贫血基因诊断在一张芯片上完成，适用于大面积普查[10]缺点是芯片造价成本较为高昂，还未能广泛使用于临床检验。
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5 胚胎种植前遗传学诊断技术诊断
携带α-地贫纯合子基因的胎儿由于血红蛋白生成障碍导致胎儿宫内水肿及死胎， 目前我们仅能够通过产前筛查避免患儿的出生，而对α-地中海贫血纯合子胎儿无有效的治疗措施[11]，建立携带α-地贫基因的人胚胎干细胞系是对α-地贫的体外基因治疗方式进行探讨的基础。邓捷等报道[12]胚胎在体外培养至第3 天，利用卵裂球活检术，由每个胚胎获得1 ～ 2 个卵裂球，进行单细胞PCR，以诊断胚胎是否携带α-地贫基因。麦庆云[13]收集经胚胎种植前遗传学诊断技术诊断为携带α-地贫纯合子基因的囊胚，进行人胚胎干细胞培养，建立携带α-地贫纯合子基因的人胚胎干细胞系。对所得人胚胎干细胞进行α-地贫基因的DNA 序列分析与全能性鉴定。结果发现α-地贫纯合子基因的人胚胎干细胞具有向三胚层细胞分化的全能性，携带致病基因的胚胎可用于建立携带遗传疾病基因的人胚胎干细胞系。
近年随着分子生物学和蛋白组学实验技术迅猛发展，α-地贫的实验室诊断技术亦随之提高。在筛查携带者、遗传咨询、产前诊断、选择性流产等方面起到了重要作用，提高了地中海贫血诊断的准确性，减少误诊和漏诊。
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参考文献
[1] 李璞,主编. 医学遗传学[M ]. 中国协和医科大学出版社, 2006.180.
[2] Viprakasit V , Tanphaichitr VS , Pung2Amritt P , et al . Clini cal phenotypes and molecular characterization of Hb H2Pakse disease [J ] . Haematologica ,2002 ,87 (2) :1172125.[3] Li Y，Di Naro E，Vitucci A，et al.Detection of paternally inherited fetal point mutations for β-thalassemia using size2fractionated cell-f ree DNA in maternal plasma[J].Am Med Assoc，2005，93：843.[4] Leung T,Lau TK,Chung TKh. Thalassaemia screening in pregnancy[J ] . Curr Opin Obstet Gynecol ,2005 ,17 (2) :1292134.[5] 边旭明. 实用产前诊断学[M] . 北京:人民军医出版社,2008.[6] 顾京红,罗来敏,黄亚绢. 脐血管穿刺安全性研究[J]. 中国妇幼保健,2006 ,21 (16) :2307.[7] S aadi H , Al exander S, Barl ow P, et al. Major alpha thalas s emia: ant en at al diagnosi s, cas e report and lit eratur e review[ J ] . J Gyn ecol Obst et Biol Reprod ( Paris ) , 2009, 38 ( 3) :258 262.[8] Baig SM.Molecular diagnosis of beta-thalassemia by mul-tiplex ARMS-PCR：a cost effective method for developing count ries like Pakistan [J].Prenat Diagn，2007，27(6)：580.[9] 王莉.地中海贫血的诊治进展[J].国际儿科学杂志,2006,33(4): 258-260.[10] Bang-Ce Y，Hongqiong L，Zhuanfong Z，et al.Simultaneous detection of alpha-thalassemia and beta-thalassemia by oligonucleotide microarray[J].Haematologica，2004，89(8)：101.[11] 陈晨春，仇小强. α-地中海贫血流行状况[J].中国妇幼保健，2009，24(10)：858-861.[12] 邓捷，彭文林，刘颖，等. 应用荧光聚合酶链反应对α-地中海贫血进行植入前遗传学诊断[J].中华医学杂志，2005，85(38)：2682-2685.[13] 麦庆云， 邓捷， 彭文林， 庄广伦， 周灿权.带α-地中海贫血基因人胚胎干细胞系的建立[J].中山大学学报(医学科学版)2009,30 (5 ):551-555., 百拇医药(毛锦江 黄伟媚)
【中图分类号】R556.7 【文献标识码】A 【文章编号】1008-6455(2011)06-0484-02
地中海贫血(thalasimia，地贫)是一组常见的常染色体隐性遗传病, 是由于α珠蛋白基因的缺失或突变功能障碍导致α珠蛋白肽链合成速率减少或不合成,造成α链和非α链合成不均衡,引起溶血性贫血[1],具有高度遗传异质性。全球约有18 亿人携带地贫基因,每年出生的各类重症地贫患儿数至少有20 万。产前筛查及超声诊断可以有效减低该病患儿的出生率。
1 发病的分子基础
α- thalasimia是具有高度异质性的单基因遗传病。编码α-珠蛋白链的基因是位于16 号染色体短臂末端的(16p13. 3-pter)α珠蛋白基因簇的成员之一。总长约29kb 包含7 个连锁的α类基因或假基因,即有2 个α基因(α1 、α2 ) ,1 个胚胎类基因(ζ2 ) ,3 个假基因(фζ1 、фα2 、фα1 ) 和1 个未知功能基因(θ) 。其中排列顺序为:5′-2-фζ1-фα2-фα1-α2-α1-θ-3′。α-Thal 主要是由于α-珠蛋白基因合成的减少或缺失所致。
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2 α地贫的基因类型
α地贫主要可以分为缺失型和非缺失型两大基因类型[2]。
2.1 缺失型α地贫-1 ：缺失从5. 2 kb 到整个基因簇不等,共有16 种类型,在中国主要是东南亚缺失型, (α-SEA占95 %;缺失型α地贫-2 ,缺失可累及1 个α基因(α1 或α2 ) 、部分α2 基因或α2 基因的5′端或α1 基因的3′端。目前已发现8 种基因型,其中最常见的两种缺失型为右缺失型(-α3. 7 ) 和左缺失型(-α4. 2 ) 。
2.2 非缺失型α地贫：指用限制性内切酶图谱法未能检出明显的基因缺失,但在其中可能包括导致基因功能丧失的小片段核苷酸的缺失、插入或碱基替代。至目前共有40 多种非缺失型α地贫被报道,在中国南方最常见的是血红蛋白Constant Spring (Hb CS) 基因突变及少量Hb Quong Sze (HbQS) 基因突变。根据基因的缺失或突变情况,临床可将α地贫分为静止型、轻型、中间型(Hb H 病) 和重型(Hb Bart′s 胎儿水肿综合征) 。
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3 α地贫的产前筛查
目前实验室诊断技术主要有筛查法和基因诊断法两种[3]。
3.1 产前筛选方法：常用筛查方法3种:血红蛋白电泳、红细胞指数、一管定量法脆性试验。目前最适当的产前筛查方法是通过血液分析仪查平均红细胞容量(MCV) 和平均红细胞血红蛋白量(MCH) 。由于红细胞储存于室温时可能会膨胀,MCH比MCV 更为可靠。以MCH < 27pg 或MCV < 80fl 为标准,基本可以完全筛查出携带者。当MCH 或MCV 小于该标准后,应进行血红蛋白电泳,若HbA2 < 2. 5 % ,则高度怀疑为α地贫基因携带者。如果发现了Hb H包涵体,则可以诊断中间型α地贫。同时还应注意血清铁蛋白测定,以排除缺铁性贫血[4]。
4 α地贫的产前诊断技术
4.1 超声诊断：是孕中期检测Bart′s水肿胎儿的简便可行方法之一。在孕12周以后,超声检测胎儿心胸比值和胎盘厚度、羊水量亦可分辩出Bart′s水肿胎儿,由于其无创伤性,简便、快速,因而超声诊断目前更易为病人所接受及乡镇卫生院的推广。
, http://www.100md.com
4.2 获取胎儿标本进行产前诊断方法：包括括绒毛活检、羊水及脐血管穿刺取血检查。
绒毛活检适用于妊娠早期,一般在孕8～10 周进行,自然流产率达2 %～3 % [5] ,目前很少用于要求继续妊娠的孕妇。
羊水穿刺是目前最常用的胎儿染色体病的产前诊断方法,穿刺流产率仅为0. 1 %～0. 2 % ,羊膜腔穿刺限于妊娠16～23 周,随着产前筛查及影像技术的发展,越来越多中、晚期妊娠孕妇要求进行产前诊断。
腹部B 超引导下穿刺胎儿脐静脉穿刺获取胎儿血标本的方法，是妊娠中、晚期产前诊断的主要方法之一。与绒毛、羊水产前诊断方法比较,脐血管穿刺能够应用于妊娠中期及晚期,能更直接、快速、准确地了解胎儿有无遗传性疾病、宫内感染及血液系统疾病,可进行胎儿血液生化学检查,应用范围更为广泛。脐血管穿刺是20 世纪80 年代以后发展起来的一项具有突破性的产前诊断技术,大大提高了产前诊断成功率、准确性及产前诊断范围,但目前在国内仍未普遍开展,其原因为人们对该操作所引起的并发症的担忧。文献[56]报道结果显示脐血管穿刺导致胎儿丢失率1 % 。
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4.3 基因诊断技术:我国对地贫的基因诊断始于20世纪80年代初，先后经历了DNA点杂交、限制性内切酶酶谱分析、限制性片段长度多态性(RFL P)连锁分析、寡核苷酸(A SO)探针杂交和PCR体外基因扩增等5个发展阶段，特别是PCR及其相关发展技术，已成为最普遍的基因诊断方法。
4.3.1 缺失型α - 地贫的基因诊断：α - 地贫是世界上最早应用DNA诊断技术进行产前诊断的人类遗传病。在PCR技术诞生以前,主要采用Hb电泳,等电聚焦,高效液相色谱分析和氨基酸测序等。采用southern方法耗时,过程敏锁,不经济、且有使用同位素的诸多不便,不可能作为常规方法。但是,由于其稳定性高,有些实验室仍和其它方法结合使用。近几年,以PCR为基础的各种新方法,已广泛应用于各型α - 地贫的基因诊断。
4.3.2 非缺失型α- 地贫的基因诊断：主要采用以PCR为基础的点突变分析法来检测目的基因, PCR是利用DNA聚合酶等在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。应用血红蛋白电泳检测对血红蛋白H病能进行较好的诊断，但对标准型和静止型的α-地贫不能进行有效诊断。以PCR为基础的诊断α-地贫的方法经历了单重、双重至多重几个阶段，近年来单管多重PCR 和基因芯片技术的应用,使α地贫的三种缺失类型-α3. 7 、α4. 2及—SEA可以快捷地同时检出。应用地贫基因诊断技术对高风险胎儿进行产前基因诊断, 淘汰重型患儿是目前国际上公认的预防对策[7]。
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多重PCR它的特点是在一个PCR体系中包含4对等位基因特异引物。根据每个突变位点的特异扩增带来判断结果。在诊断各种缺失型α-地中海贫血时，相对于传统的Southern杂交技术，操作简单，周期短，不使用放射性核素，便于临床推广[8]。单管多重PCR 东南亚缺失型自身组合或与左、右缺失型相互组合可分别导致致死性的Hb Bart’s 胎儿水肿综合征和严重影响生存质量的Hb H 病。
4.3.3 基因芯片检测方法：地贫诊断基因芯片(ThalachipTM) 是一种基于DNA 芯片技术识别中国地区已知地贫基因型的新技术,专为快速检测α和β珠蛋白基因中的DNA 缺失和突变而设计,能够同时检测中国地区最常见的α3. 7 、α4. 2和-SEA三种α地贫[9] 。根据基因芯片上不同位置所出现的荧光位点颜色及强弱的变化来判断地中海贫血的基因突变类型，与传统方法比较，基因芯片诊断技术在核酸扩增的基础上，采用荧光标记及引物延伸的方法，可提高检测结果的敏感性和特异性，由于基因芯片高通量特点，可将α、β地中海贫血基因诊断在一张芯片上完成，适用于大面积普查[10]缺点是芯片造价成本较为高昂，还未能广泛使用于临床检验。
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5 胚胎种植前遗传学诊断技术诊断
携带α-地贫纯合子基因的胎儿由于血红蛋白生成障碍导致胎儿宫内水肿及死胎， 目前我们仅能够通过产前筛查避免患儿的出生，而对α-地中海贫血纯合子胎儿无有效的治疗措施[11]，建立携带α-地贫基因的人胚胎干细胞系是对α-地贫的体外基因治疗方式进行探讨的基础。邓捷等报道[12]胚胎在体外培养至第3 天，利用卵裂球活检术，由每个胚胎获得1 ～ 2 个卵裂球，进行单细胞PCR，以诊断胚胎是否携带α-地贫基因。麦庆云[13]收集经胚胎种植前遗传学诊断技术诊断为携带α-地贫纯合子基因的囊胚，进行人胚胎干细胞培养，建立携带α-地贫纯合子基因的人胚胎干细胞系。对所得人胚胎干细胞进行α-地贫基因的DNA 序列分析与全能性鉴定。结果发现α-地贫纯合子基因的人胚胎干细胞具有向三胚层细胞分化的全能性，携带致病基因的胚胎可用于建立携带遗传疾病基因的人胚胎干细胞系。
近年随着分子生物学和蛋白组学实验技术迅猛发展，α-地贫的实验室诊断技术亦随之提高。在筛查携带者、遗传咨询、产前诊断、选择性流产等方面起到了重要作用，提高了地中海贫血诊断的准确性，减少误诊和漏诊。
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参考文献
[1] 李璞,主编. 医学遗传学[M ]. 中国协和医科大学出版社, 2006.180.
[2] Viprakasit V , Tanphaichitr VS , Pung2Amritt P , et al . Clini cal phenotypes and molecular characterization of Hb H2Pakse disease [J ] . Haematologica ,2002 ,87 (2) :1172125.[3] Li Y，Di Naro E，Vitucci A，et al.Detection of paternally inherited fetal point mutations for β-thalassemia using size2fractionated cell-f ree DNA in maternal plasma[J].Am Med Assoc，2005，93：843.[4] Leung T,Lau TK,Chung TKh. Thalassaemia screening in pregnancy[J ] . Curr Opin Obstet Gynecol ,2005 ,17 (2) :1292134.[5] 边旭明. 实用产前诊断学[M] . 北京:人民军医出版社,2008.[6] 顾京红,罗来敏,黄亚绢. 脐血管穿刺安全性研究[J]. 中国妇幼保健,2006 ,21 (16) :2307.[7] S aadi H , Al exander S, Barl ow P, et al. Major alpha thalas s emia: ant en at al diagnosi s, cas e report and lit eratur e review[ J ] . J Gyn ecol Obst et Biol Reprod ( Paris ) , 2009, 38 ( 3) :258 262.[8] Baig SM.Molecular diagnosis of beta-thalassemia by mul-tiplex ARMS-PCR：a cost effective method for developing count ries like Pakistan [J].Prenat Diagn，2007，27(6)：580.[9] 王莉.地中海贫血的诊治进展[J].国际儿科学杂志,2006,33(4): 258-260.[10] Bang-Ce Y，Hongqiong L，Zhuanfong Z，et al.Simultaneous detection of alpha-thalassemia and beta-thalassemia by oligonucleotide microarray[J].Haematologica，2004，89(8)：101.[11] 陈晨春，仇小强. α-地中海贫血流行状况[J].中国妇幼保健，2009，24(10)：858-861.[12] 邓捷，彭文林，刘颖，等. 应用荧光聚合酶链反应对α-地中海贫血进行植入前遗传学诊断[J].中华医学杂志，2005，85(38)：2682-2685.[13] 麦庆云， 邓捷， 彭文林， 庄广伦， 周灿权.带α-地中海贫血基因人胚胎干细胞系的建立[J].中山大学学报(医学科学版)2009,30 (5 ):551-555., 百拇医药(毛锦江 黄伟媚)
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