细辛脂素联合受体脾细胞诱导心脏移植免疫耐受的研究(2)
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移植前7天，Wistar大鼠用1%戊巴比妥钠按40mg/kg腹腔注射麻醉后，小心推开肠管，无菌切除脾脏。然后将脾脏置于放有冰块的平皿内，去掉被膜，将脾脏剪碎成匀浆状，剪碎后的脾组织匀浆用Tris-NH4Cl溶解红细胞，再用Hanks液洗涤3次，200目钢网过滤，制成脾细胞悬液。用RPMI1640液调细胞浓度为2.5×107ml-1。台盼兰拒染法判断细胞活性大于95%。37℃ 5% CO2条件下培养。
移植前7天，取配对SD大鼠，用1%戊巴比妥钠按40mg/kg腹腔注射麻醉，颈胸部纵切口，显露胸腺，用微量进样器(针头直径0.32mm)将供者特异性抗原细胞一次性均匀注入配对C组和D组受体SD大鼠的胸腺两侧。移植前3天，将供者特异性脾细胞注入E组配对受体的胸腺两侧。剩余脾细胞继续培养。
1.2.4 术后处理和分组:术后40℃恒温箱保温6小时。大鼠于术后2小时左右清醒。术后1-2日用5%葡萄糖盐水喂养，以后改为正常饲养。每日腹部触诊检查移植心状态。术后第3日将移植存活良好(搏动有力，心率180-250次/分，心律规整)的大鼠进入各实验组，手术成功率为98%，全部手术均由两个术者配合完成。供体Wistar大鼠，受体SD大鼠，全部动物共分5组：
A组：阳性对照组，行腹部异位心脏移植，不给任何处置；
B组：细辛脂素组，行腹部异位心脏移植，术前7天开始灌服细辛脂素25 mg·kg-1·d-1；
C组：脾细胞诱导组1，术前7天开始输注供者脾细胞于受体胸腺内；
D组：脾细胞诱导组2，术前7天开始输注供者脾细胞于受体胸腺内，术前7天开始灌服细辛脂素25 mg·kg-1·d-1；
E组：脾细胞诱导组3，术前3天开始输注供者脾细胞于受体胸腺内，术前7天开始灌服细辛脂素25 mg·kg-1·d-1。
每组各8只术后第7天处死。另外8只用于观察移植物生存天数，以供心停跳当日作为排斥反应终点。
1.2.5 标本的采取:受体经戊巴比妥钠麻醉，常规固定、消毒、铺巾同前，切开腹壁，暴露下腔静脉。用无菌注射器经下腔静脉采血5ml，低温离心3000r/min无菌分离血清，分装后低温冰箱保存备测。手术取出脾脏,制成脾细胞悬液2.5×107/ml。
1.3 单向混合淋巴细胞培养:于术后7天进行，采用RPMI-1640培养液，加入配对供受体脾细胞悬液各0.1ml，另设E、F、G组加入无关Wistar大鼠脾细胞，于96孔板行混合淋巴细胞培养。Wistar大鼠脾细胞经丝裂霉素C(200？g/ml)处理30min，加样表如下,每个反应体系设三个复孔，应用MTT比色法检测脾细胞增殖程度。
1.4 检测指标
1.4.1 移植物生存天数观察。
1.4.2 单向混合淋巴细胞反应。
1.4.3 细胞因子检测：ELISA法检测受体外周血IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10。按试剂盒说明操作。
1.5 统计学处理:计量资料均以均数±标准差表示(x±s)，样本均数的比较用t检验，以P>0.05为无显著性差异，以P<0.05为具有显著性差异，以P<0.01为具有极显著性差异。
2 实验结果
2.1 移植物生存天数:脾细胞诱导组2和脾细胞诱导组3移植物生存天数较阳性对照组明显延长(P<0.01)，结果见表1。
Table1 Survival time of grafts in the receptor (d)
注：**与阳性对照组相比P<0.01
2.2 单向混合淋巴细胞反应:吸光度与脾细胞增殖程度成正比，各C、D、E免疫诱导组与阳性对照组OD值有显著性差异，各免疫诱导组脾细胞增殖程度明显降低(P<0.01)。脾细胞诱导组之间有显著性差异，以脾细胞诱导组2抑制效果最好(P<0.05)其刺激效应最低23%。各组吸光度值见表2。 MLR的刺激效应按照下列公式计算，结果见图1。刺激效应计算公式如下:
刺激效应(实验孔A值-对照孔A值)/对照孔A值×100%
Table 2: The result of MLR (OD×10-2)
注：*与A组相比P<0.05 **与A组相比P<0.01
2.3 外周血细胞因子检测结果:与阳性对照组相比，受体血清细胞因子脾细胞诱导组IL-2和IFN-γ含量降低，IL-4、IL-10含量升高。结果见表3。
Table 3 The level of IL-2, IFN-γand IL-4 in serum(pg/ml)
注：*与阳性对照组相比P<0.05 **与阳性对照组相比P<0.01 Δ与脾细胞诱导组2相比P<0.05。
3 讨论
中药细辛中提取的细辛脂素具有一定的免疫抑制作用已得到证实〖2〗，并且发挥抗排异反应作用时可能与提高了免疫耐受有关，但它的抗排异反应作用弱于CsA。免疫耐受是指器官移植受者在不应用或停用免疫抑制剂的情况下，对移植的异体器官特异性地不产生免疫排斥或处于低反应状态而使其长期存活，它是以克隆无反应和免疫抑制等外周耐受机制为主。诱导耐受的方法分为中枢耐受和外周耐受。胸腺是重要的中枢免疫器官，又是一个“免疫特惠”器官，未成熟的T细胞在胸腺分化发育过程中，必须经过阳性选择和阴性选择才能分化发育成能与异物抗原发生反应的CD4+或CD8+的单阳性细胞，随血液循环进入外周淋巴器官中定居。阴性选择过程中，胸腺皮质和髓质交界处的巨噬细胞和树突细胞表达高水平的的MHC I、II类抗原，后者与自身抗原形成复合物〖3-4〗。经过阳性选择的胸腺细胞识别此抗原复合物，将此视为自身抗原，并引起针对这类抗原的T细胞克隆消除，并由此产生免疫耐受。
本实验结果表明，注入2.5×107的脾细胞联合细辛脂素，在术前7日可以诱导出大鼠心脏移植的免疫耐受，并且经混合淋巴细胞培养证实，免疫耐受具有供体特异性，但在术前7日预处理组较术前3日预处理组移植物生存时间长、外周血细胞因子IL-4、IL-10升高明显 ......
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