脑梗死患者的对氧磷脂酶－１活性及其基因多态性研究
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1.外周血提取DNA方法
(1)外周血单个核细胞分离：采集2—3ml枸橼酸钠抗凝静脉血，加入生理盐水稀释后，按常规方法以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，置—20℃冰箱保存待用。
(2)DNA提取：分别加入5mg/ml蛋白酶K80μl，10%SDS 80ul和1ml核裂解液于含有单个核细胞管中，混匀；置56℃恒温器中，孵育2—4小时，加入5M NaCl310μl颠倒混匀，13000rpm离心10分钟，吸起上清液500μl于另外一个试管中，加入—20℃冰箱预冷的无水酒精1ml，颠倒混匀直至白色絮状出现，13000rpm离心10分钟，弃上清液，加入—20℃冰箱预冷的70%酒精1 ml，颠倒混匀，13000rpm离心10分钟，弃上清液，55℃烘干10—20分钟，加入50—200μl水溶液，置—20℃冰箱保存待用。
2.PON-1 PCR实验操作
pon-1的192/55基因检测的引物：根据文献[7]报道的引物序列委托上海生工公司合成，引物系列见表1。
(2) PCR反应条件：在25ul 反应体系中,含有2 .5ul 1×buf , 1.5mmolMgCl2,200μmol dNTPs ,1U Taq酶,4% DMSO,200pmol引物对,100ng DNA,置于PE9600热循环仪中,PCR反应参数为：94℃3分钟后,按94℃60秒,60℃60秒,72℃60秒,反复循环35次,最后72℃延伸7分钟,结束PCR反应 ......
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