比色法测定静注人乙肝免疫球蛋白中麦芽糖的含量
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【摘要】 目的：建立一种快速简便检测静注人乙肝免疫球蛋白(HBIGIV)中麦芽糖的含量。方法用比色法测定静注人乙肝免疫球蛋白中麦芽糖的含量。结果麦芽糖含量的线性范围5mg﹒mL-1～40 mg﹒mL-1，平均回收率(n=6)为99.4%，RSD为1.13%。结论本方法准确、简便，适用于测定静注人乙肝免疫球蛋白中麦芽糖含量的测定。
关键词：比色法；静脉注射用人乙肝免疫球蛋白；麦芽糖；含量
Determination of malt sugar in human hepatitis B immunoglobulin for intravenous use by colorimetry
[Abstract:] Objective: To establish a rapid and simple method of colorimetry for the determination of the content of malt sugar in human hepatitis B immunoglobulin for intravenous use. Methods: Colorimetry was applied to quantitative analysis. Results: The calibration curves ofmalt sugar werelinear in the concentration range from 5mg﹒mL-1~40 mg﹒mL-1,the average recovery and RSD were 99.4%(n=6) and 1.13%, respectively. Conclution: The method is accurate, simple and can be adopted for determining the malt sugar in HBIGIV.
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Key Words:Colorimetry;Hbigiv;Malt Sugar;Content
人乙肝免疫球蛋白是用于预防乙肝病毒感染及阻断乙肝病毒母婴垂直传播的一种特异性免疫制剂[1]，由含有高效价乙肝抗体的健康人血浆中提取精制而成[2]。目前我国批准上市的人乙肝免疫球蛋白为肌肉注射剂[3]，静脉注射用人乙肝免疫球蛋白在欧洲药典中已有收载[4]。麦芽糖作为该制剂中的添加辅料，其含量是重要的质量控制指标。由于麦芽糖分子没有共扼结构，不能产生紫外吸收，故不能直接利用紫外分光光度法测定其含量。但麦芽糖分子含有的自由醛基，能与费林试剂反应，使其在700nm处的吸收强度随麦芽糖含量增加而减弱[5]。故本文用比色法对静脉注射用人乙肝免疫球蛋白中的麦芽糖含量进行测定。
1 仪器与试药
HPUV8452A紫外分光光度计；费林试剂(自制)；麦芽糖标准品(chem. service Inc.)；台式离心机(80-2B型，上海安亭科仪厂)；静脉注射用人乙肝免疫球蛋白冻干粉(蛋白含量5%，批号20060501、20060502、20060503，试制)；其他化学试剂为分析纯。
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2 方法与结果
2.1 费林试剂制备
甲液：称取15g硫酸铜(CuSO4·5H2O)及0.05g亚甲基蓝，溶于蒸馏水中并稀释到1000mL。
乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g NaOH，溶于蒸馏水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。临用时将甲，乙两液等体积混合，即得。
2.2.1 标准品储备液：麦芽糖标准品经85℃干燥恒重，精密称取5.0028克，放入100ml容量瓶，加水溶解并稀释到刻度。
2.2.2 供试品溶液：准确称取1.00g静脉注射用人乙肝免疫球蛋白冻干粉，置于10ml容量瓶，加入1.5%磺基水杨酸至刻度，沉淀后离心(3000rpm，10min)，上清液用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液。
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2.2.3 阴性对照溶液：按工艺规程制备静脉注射用人乙肝免疫球蛋白液，不加麦芽糖，取此空白蛋白液10ml，置于10ml容量瓶，加入1.5%磺基水杨酸至刻度，沉淀后离心(3000rpm，10min)，上清液用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液。
2.3 系统适应性及专属性试验
临用前分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液分别加入等体积费林试剂，摇匀，沸水浴5min，冷却至室温，离心后，用分光光度计在400-800nm波长范围扫描，结果表明，对照品、供试品在700nm波长处有最大吸收，阴性对照品在相应位置无吸收。试验结果表明人乙肝免疫球蛋白溶液经沉淀离心除蛋白后不含有麦芽糖检测的干扰物质，系统适应性及专属性良好。
2.4 线性关系考察
精密吸取标准品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml，分别放入10ml容量瓶，加水到刻度，摇匀即得系列浓度的对照品溶液。分别取配制好的各浓度对照品溶液2ml，加入等体积费林试剂，摇匀，沸水浴2min，冷却至室温，离心，在波长700nm处测定其吸光度(A)。计算得回归方程y=0.05448x++0.00226，r＝0.998。实验结果表明本法检测麦芽糖含量在5 mg﹒ml-1～40mg﹒ml-1范围内线性关系良好。
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2.5 精密度试验
麦芽糖对照品溶液，重复测定6次，记录吸收度。计算得RSD为0.15%，表明试验方法精密度良好。
2.6 重复性试验
取同一批号供试品6份，按供试品溶液配制方法制样，测定麦芽糖含量，计算相对标准偏差RSD。计算得麦芽糖平均含量100.6 mg﹒ml-1，RSD为0.35%，表明试验重复性良好。
2.7 加样回收率试验
取10ml相同批号的供试品6份，准确称重6份麦芽糖标准品，分别加入供试品中，按供试品溶液配制方法制样，临用前加入等体积费林试剂，摇匀，沸水浴5min，冷却至室温，离心，在波长700nm处测定其吸光度(A)，计算样品麦芽糖含量平均回收率。计算结果如表2，平均回收率99.4%，RSD=1.13%。
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表2 麦芽糖回收率试验结果(n=6)
Tab 2 Results of recovery of malt sugar (n=6)
2.8 样品含量测定
按照“2.2.2 供试品溶液配制” 的方法制样，临用前加入等体积费林试剂，摇匀，沸水浴5min，冷却至室温，离心，在波长700nm处测定其吸光度(A)，计算麦芽糖含量。本品为蛋白含量5%的人乙肝免疫球蛋白静脉注射溶液，其中麦芽糖含量应控制在100±10 mg﹒ml-1。测定并计算结果如下表3。
表3 样品中麦芽糖含量测定结果(n=3)
Tab 3 Results of determination of malt sugar in samples (n=3)
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3 讨论
麦芽糖在静注人乙肝免疫球蛋白制剂中作为蛋白质的稳定剂，具有维持蛋白质活性结构、防止蛋白质沉淀变性的作用。麦芽糖含量是该制剂的一项重要质控指标，麦芽糖含量过低不能有效起到蛋白质保护剂的作用，含量过高可能对接受输液的糖尿病患者不利，因此准确控制制剂中麦芽糖含量十分重要。
在制备供试品溶液时，加入4倍体积1.5%的磺基水杨酸溶液，不仅可以将供试品中的蛋白质沉淀除去，而且将麦芽糖含量稀释到20mg﹒ml-1左右，使所得结果准确可靠。
参考文献
1赵军，李荣贞. 人乙肝免疫球蛋白临床应用研究进展[J]. 中华现代内科学杂志，2005，8(2)：726-727.
2中国生物制品标准化委员会. 中国生物制品规程[M]. 北京：化学工业出版社，2000，338.
3中国药典委员会.中国药典[M]. 北京：化学工业出版社，2005，183.
4European pharmeuropa 3rd, 1997, 2328.
5黄文武，邵秋霞，马岚. 应用比色法测定静脉注射用人血球蛋白中麦芽糖含量[J]. 中国生物制品学杂志，2000，13(1)：53-54., 百拇医药(吴明东 许文举 李其国 庞谢辉)