TLC结合HPLC法检测保健食品及中成药中掺加化学降糖药物的研究(2)
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3.4.1检测波长的选择取上述各对照品母液加甲醇稀释成约10μg·ml-1的溶液，在190 nm～370 nm的波长范围内进行扫描，测得格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列吡嗪的最大吸收波长为235 nm左右。故本实验选择235 nm作为检测波长，以便同时测定上述5种药物。
3.4.2流动相的选择根据文献报道，分别配制了5 mmoL·L-1庚烷磺酸钠溶液-乙腈、5 mmoL·L-1四丁基溴化铵溶液-乙腈、50 mmoL·L-1磷酸二氢钾溶液-乙腈、20mmoL·L-1乙酸铵溶液(+0.1%乙酸)-乙腈、20mmoL·L-1枸橼酸盐缓冲液-乙腈、20mmoL·L-1乙酸胺溶液-0.1%的乙酸-乙腈、0.5%醋酸-乙腈、0.5%醋酸-乙醇-乙腈，在本研究中考察了上述流动相对各物质色谱行为的影响，发现5 mmoL·L-1庚烷磺酸钠溶液-乙腈、5 mmoL·L-1四丁基溴化铵溶液-乙腈分别作为流动相时，其色谱峰拖尾，有很多杂质峰，且在室温低的时候容易出现浑浊；50 mmoL·L-1磷酸二氢钾溶液-乙腈、30 mmoL·L-1醋酸铵溶液-乙腈分别作为流动相时，各物质色谱峰峰形好，且能够完全分离开来，但为了保护柱子，因有磷酸盐的流动相，故选择20 mmoL·L-1乙酸铵溶液(+0.1%乙酸)-乙腈作为流动相。
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3.4.3 流速的影响 考察了0.8 ,1.0 ,1.2ml·min -1三个流速，流速太小，出峰时间长且拖尾严重，色谱峰扩宽；流速太大，各组分保留时间均减小，导致峰分离不好，尤其是替硝唑和塞克硝唑分离不好，故本研究选用出峰时间和峰形较理想的流速为1.0ml·min -1。
3.4.4柱温的影响 考察了20,30,40,50 ℃四种温度，温度越高，出峰越快，且柱效高，但高于30℃后变化不明显，但温度太高对色谱柱不利，故本研究柱温设定为30 ℃。
3.5 实验结果
3.5.1 HPLC色谱分离情况取上述各对照品母液加甲醇分别配制成约20μg·ml -1的溶液及其混合液浓度为20 μg·ml -1，依选定的色谱条件，上机进行分析，记录色谱图，在选择好的实验条件下，格列本脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲5种药物与干扰完全分开，且峰形良好，其保留时间(tR)分别为：24.8 min，16.9min，12.1min，37.7min，26.7min。具体色谱图见图3。
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图3A ：格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列吡嗪、格列美脲混合对照品的HPLC图
B ：中成药糖胶囊S5的HPLC图 C ：阴性样品S1的HPLC图D:食品样品S12的HPLC图
Fig 3A ：Chromatograms of Glibenclamide,Gliclazide,Glipizide,Gliquidone,Glimepiride
B ：Chromatograms ofthe sampleC :Chromatograms ofthe blankD: Chromatograms ofthe food
3.5.2标准曲线的制备分别精密量取上述对照品溶液各1.0ml,2.0ml,3.0ml,4.0ml,5.0ml分置50ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述选择好的色谱条件进样，记录色谱图，以峰面积(A)对浓度(C)进行线性拟合，得到格列本脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲的回归方程分别为： A格列本脲= 1.11×105 C-3.85×105，r=0.9993，(n=3);A格列齐特= 0.71×105 C-5.15×105，r=0.9998，(n=3); A格列吡嗪= 0.90×105C-2.90×105，r=0.9993，(n=3); A格列喹酮= 9.38×104 C+0.66×104，r=0.9993，(n=3); A格列美脲= 7.18×104 C+0.72×104，r=0.9995，(n=3);线性范围分别为：12.50～62.50μg·ml -1，8.40～42.00 μg·ml -1，13.28～66.40μg· ml -1，9..96～49.80 μg·ml -1， 8.96～44.80 μg·ml -1。
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3.5.3 最低检测限的确定根据检出限(S/N≥3)定义为产生相应于三倍背景噪音的标准差分析信号的分析物浓度值。据此定义计算出格列本脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲的检出限分别为0.160 ，0.641 ，0.071，0.085，0.102μg。
3.5.4精密度考察 取标准曲线项下浓度为30 μg·ml -1的对照品溶液进样分析，每天处理5份数据，连续做3 d，求得其日内日间的RSD，具体见表1。
3.5.5重复性试验取标准曲线项下浓度约为30μg·ml -1的对照品溶液连续进样5次，记录色谱图，其峰面积的相对标准偏差RSD分别为1.9%，2.1%，2.9%，1.1%、1.2%。
3.5.6 回收率实验精密量取上述配制好的阴性中成药胶囊S4溶液3 ml置50 ml容量瓶中，再精密加入上述配制好的对照品溶液各2.0 ,3.0 ,4.0 ml分置上述50 ml容量瓶中(各平行试验5份)，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按标准曲线项下操作，代入标准曲线方程求出各自的回收率，具体见表2。
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3.5.7样品测定结果采用上述选择好的色谱条件，取配制好的对照品溶液和样品溶液上机进行分析，记录色谱图，根据外标法，求出其含量，结果见表3。
4讨论
4.1 采用三氯甲烷作为溶剂时，提取较完全且干扰物质少。
4.2选择石油醚-乙酸乙酯-氯仿-无水乙醇-甲酸(10：5：2：1：0.1)为最佳展开剂。
4.3HPLC法试验中样品提取的溶剂的选择，分别采用了甲醇、氯仿、乙酸乙酯、甲醇-氯仿(1：1)，通过实验得到，当溶剂采用甲醇时，其萃取率最好(95%)且峰型最好，故选用甲醇作为溶剂。
4.4 本试验建立的实验条件可以把格列本脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲在同一色谱条件下同时完全分离开来，为检测中成药中是否非法加入这5种化学药品，奠定了技术基础，为保障人们的用药安全，将会有很大的实际应用意义。同时对本试验检测所得的阳性样本用HPLC-MS进行了验证实验，结果液相色谱法和用质谱法检测的结果一致，说明该法具有良好的准确性。
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参考文献
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