芍药苷对人肝癌细胞ＨｅｐＧ－2凋亡及其调控基因的影响
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晏雪生 李瀚曼 彭亚琴 明安萍
摘 要：目的：研究芍药苷诱导人肝癌细胞株HepG-2细胞凋亡的作用及机制。方法：采用人肝癌细胞株HepG-2细胞药理学方法，观察芍持苷对HePG-2细胞凋亡及凋亡相关调控基因Bax、Bcl-2及抑癌基因P53表达的影响。结果：芍药苷2mg/mL对HepG-2细胞增殖均有显著押制作用(31.45%)，其细胞凋亡率(21.67%)显著高于无药对照组(3.06%)。芍药苷上调凋亡调控基因Bax、P53的表达与无药对照组比较，差异显著，且呈剂量依赖关系，P<0.05。结论：芍药苷能在一定程度上抑制HepG-2细胞的增殖和诱导其凋亡，其作甩机理之一可能是上调促凋亡基因Bax和P53的表达。
关键词：芍药苷；药理学；肿瘤；细胞凋亡；Bcl-2基因家族
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)07-1346-02
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芍药苷主要从毛茛科植物芍药Paeonia Lactiflora Pall中提取，既往报道芍药有一定的抗肿瘤作用及保肝作用，提示芍药苷可能具有抗肝癌的药理作用。本实验运用现代细胞药理学实验方法，观察芍药苷对人肝癌细胞株HpG-2凋亡及其相关调控基因表达的影响，初步探讨芍药苷的抗肝癌作用及机制。
1 材 料
芍药苷标准品，中国药品生物制品检定所提供，批号：0736-200014。阿霉素注射液，浙江海正药业股份有限公司(13550)。Bax、Bcl-2、P53单抗和S-P法免疫组化试剂盒由福建迈新公司提供。人肝癌细胞株HepG-2从美国引时，倒置相差显微镜，日本OLYMPUS公司产品。CO2培养箱，美国SHELLAB公司产品。流式细胞仪，2000FCA，美国BD公司生产。
2 方 法
人肝癌细胞株HepG-2接种于含10%新生牛血清、抗生素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的DMEM培养基中。培养环境为5%CO2、37℃、饱和湿度。细胞3-5天传代，以O.25%胰蛋白酶消化1：3传代。取对数生长期细胞调整浓度为1×105/mL接种于96孔板中。培养24h后.加入含不同药物浓度的培养基，阿霉素10μmol/L作为阳性对照组。继续培养48h后，采用MTT法检测并计算细胞增长抑制率[抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%]。采用流式细胞仪检测HepG-2凋亡率。采用免疫组化法检测凋亡调控基因Bcl-2、Bat、P53，的表达。
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3 结 果
3.1 芍药苷对肝癌细胞HepG-2增殖的影响芍药苷2、1、0.5mg/mL3个剂量对HepG-2细胞增殖均有显著抑制作用，最高抑制率可达31.45%，P<0.01。抑制作用随药物浓度增高而有加强趋势，P<0.01，见表1。
3.2 流式细胞仪检测HepG-2凋亡率1mg/mL芍药苷作用HepG-2细胞48h后，细胞凋亡率(15.13%)高于相应无药对照组的(3.49%)，P<0.05，2mg/mL芍药苷作用HepG-2细胞48h后的细胞凋亡率(21.67%)显著高于无药对照组(3.49%)，P<0.05。结果见表2。
3.3 芍药苷对HepG-2细胞凋亡调控基因的影响Bax，Bd-2，P53蛋白主要定位于细胞浆，也可见于细胞膜。Bax、P53表达显色较对照组明显加深，呈强染色，且阳性细胞数明显增多，经统计学处理，有显著性差异，P<0.05或P<0.01。且呈剂量依赖关系。见表3。
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4 讨 论
现代药理研究表明，芍药具有免疫调节、镇痛、镇静、解痉、保肝、扩张血管、抗肿瘤、抗炎、改善学习记忆行为等作用。芍药苷等单萜类化合物是这些生理活性的主要物质基础。
HepG-2细胞具有典型肝癌细胞的一系列恶性特征，是研究和评价防治肝癌药物的较理想细胞模型。实验结果表明，芍药苷2、1、0.5mg/mL3个有效药物浓度对HepG-2细胞增殖有显著抑制作用，其最大抑制率可达31.45%。提示芍药苷能在一定程度上抑制人肝癌细胞的增殖以延缓肝癌的增殖。
流式细胞仪检测具有检测的细胞数量大，其反映群体细胞的凋亡状态比较准确的特点。流式细胞仪检测HepG-2凋亡率的结果表明，2mg/mL芍药苷作用HepG-2细胞48h后的细胞凋亡率(21.67%)显著高于相应无药对照组(3.49%)，P<0.05。
Bd-2基因家族是哺乳动物细胞中调节凋亡最重要的调控基因之一，当Bax蛋白或蛋白同源二聚体占优势时，细胞凋亡可被诱导；当Bcl-2蛋白或蛋白同源二聚体占优势时，细胞凋亡被抑制。有研究表明，P53基因为肝癌细胞凋亡的重要调控因子，缺乏野生型P53(Wt-P53)鼠肝癌细胞对原本有效的凋亡刺激不敏感，P53的表达可诱导肝癌细胞的凋亡。笔者的实验结果表明，芍药苷能上调人肝癌HepG-2细胞凋亡调控基因Bax、P53的表达，与无药对照组比较，有显著性差异，P<0.05，且呈剂量依赖关系。
芍药苷毒性很小，笔者又发现其能诱导人肝癌细胞凋亡的药理作用，这就将其开发成安全有效的防治原发性肝癌的新型中药制剂提供了实验依据。, 百拇医药(晏雪生 李瀚曼等)