巴戟天水提取物对人精子顶体氧化损伤的保护作用(1)
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杨 欣 张永华 丁彩飞 颜志中 杜 静
摘 要：目的：观察巴戟天水提取物对人精子顶体结构和功能氧化损伤的保护作用，探讨巴戟天治疗男性不育症的作用机制。方法：采用Percoll梯度离心法选择具有正常生理功能的精子作为精子模型，应用次黄嘌吟-黄嘌呤氧化酶(HX-XO)体系产生活性氧(ROS)，在有氧环境下，ROS、不同剂量的巴戟天水提取物与精子悬液共同孵育后，检测精子顶体完整率，透射电镜观察精子顶体和超微结构，并与已知的抗氧化剂维生素C对照。结果：在ROS作用下，精子的顶体受损，顶体完整率明显下降，与正常者相比差异极显著(P<0.001)，巴戟天水提取物小、中、大剂量组在相同条件下均可明显减轻ROS对精子顶体所造成的氧化损伤程度，与VitC相比较，0.25和O.5g/mL巴戟天水提取物的作用更明显(P<0.05，P<0.01)。结论：适宜剂量的巴戟天水提取物对ROS所致人精子过氧化损伤具有明显干预作用，对精子顶体结构和功能具有保护作用。
关键词：巴戟天；精子；顶体；氧侣损伤
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中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)07-1423-02
精子顶体缺陷与男性不育有着密切关系。研究表明，活性氧类(Reactive Oxygen Species，ROS)所介导的脂质过氧化作用可引起精子结构与功能改变，是男性不育的一个重要病因。传统中药巴戟天(Morinda officinalisHOW.)具有补肾阳、强筋骨、祛风湿功效，是治疗男性不育症的常用药物。笔者实验研究表明，巴戟天水提取物能显著改善精子运动功能，对精子膜功能具有保护作用。本实验采用体外培养的方法，在有氧环境下，观察巴戟天水提取物对ROS所致人精子顶体结构和功能氧化损伤的保护作用。试图为应用中药巴戟天治疗男性不育症提供实验依据。维生素C是一种水溶性的ROS高效清除剂，还具有还原剂的性质，在细胞内外起着重要的清除氧自由基和抗脂质过氧化作用，因此本实验以其为阳性对照药。
1 材料与方法
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1.1 主要仪器和试剂
WLIY-9000伟力彩色精子质量检测系统(配有恒温装置，北京伟力新世纪科技发展有限公司)，2K15C11加热型冷冻高速台式离心机(德国sigma公司)，FOtLMA-3111水套式二氧化碳细胞培养箱(美国热电公司)，JEM-1200EX透射电镜(日本JEOL公司)。
Percon液(Sigma公司，批号：P7828)，10×Earle’s液(Sigma公司，批号：E7510)，1×Earle’s液(Sigma公司，批号：E7883)，次黄嘌呤(HX，Sigma公司，批号：X-1882)，黄嘌呤氧化酶(XO，Sigma公司，批号：X-1875)，维生素C(VitC，Sigma公司，批号：A-7506)。90%和45%Percoll液的制备参见文献。
1.2 正常精子模型制备
25-35岁的健康且有生育能力的自愿供精者15名，禁欲3-5天，手淫留取精液于干燥无菌容器，经计算机辅助精子分析(computer-aided sperm analysis，CASA)系统常规分析，精子密度>60×106/mL，a级精子>25%，a+b级精子>50%，正常形态精子>60%，WBC<1×100/mL。采用Percoll梯度离心法制备具有正常生理功能的精子悬液。具体操作如下：在14mL离心管中先加入2mL 90%Per-coil，在其上层轻缓加入2mL 45%Percoil，然后在45%Per-coil的上层轻缓加入2mL已液化的精液；300r/min离心20min；吸去精液层和45%Percoll层，将90%Percoil层与4mL的Earle’S液混匀，300f/min离心10min，弃上清，沉淀用适量Earle’s混悬，并调精子数为20×106/mL。
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1.3 药物来源及制备
1.3.1 来源 巴戟天购自浙江省医药公司，经本院杜静主任药师鉴定确认为茜草科植物巴戟天Morinda officinalisHow的干燥根。
1.3.2 制备由本院制剂室制备。取巴戟天若干加10倍量双蒸水浸泡300min，煎煮30min，滤布过滤，滤渣再加5倍量水同上法再处理2次，各煮沸30和15min，合并3次滤液，用聚乙烯微孔滤管在减压下过滤，除去煎出液中的悬浮粒子，滤液于70-80℃水浴中浓缩至每1mL药液相当于0.5g生药量，冷藏保备用。
1.4 方 法
1.4.1 分组将精子悬液分为6组：正常组为PBS缓冲液(pH7.4)；模型组为HX—XO(HX终浓度为1mmol/L,XO终含量为50 mU/mL；阳性药对照组为维生素C(终含量为0.25mg/mL)+HX-XO(终浓度/含量同模型组)；巴戟天小、中、大剂量组为巴戟天水提取物(终含量分别为0.125、O.25、0.5g/mL)+HX-XO(终浓度/含量同模型组)；各组样本置37℃，5%CO2培养箱中孵育1-2h。
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1.4.2 观察指标及方法①精子顶体完整率：各组精子悬液孵育2h后，取样5μ涂片，95%乙醇固定10min，自然干燥；瑞一姬氏染液染色60s，瑞一姬氏染液加等量PBS(pH6.9)再染10min；自来水冲洗，染片置于95%乙醇中浸泡2-5s，脱掉片膜上的浮色，自然干燥，光学树脂封片，置于油镜下镜检。计数200条精子，求出精子顶体完整率(即顶体完整精子所占的百分率)。顶体完整率(%)=顶体完整的精子数/精子总数×100%。②精子电镜标本的制备及透射电镜观察：各组精子悬液孵育1h，2000r/min离心10min，轻轻吸去上清；沿管壁缓慢加入2.5%戊二醛，静置4℃固定4h；取出固定的精液凝块，切成1mm×1mm×1mm24块，用0.1mmol/L PBS缓冲液漂洗4-6次(0.5-2.0h/次)，再经1%锇酸后固定(4℃，1.5h)，按照电镜制样常规脱水、浸透，环氧树脂Epon812包埋和聚合，超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，JEM-1200EX透射电镜观察精子的超微结构。
1.5 统计学方法
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结果用x±s表示，采用SPSS12.0统计软件包进行方差齐性检验和单因素方差分析。
2 结 果
2.1 精子顶体完整率
ROS作用后精子顶体膜结构明显受损，维生素C组和巴戟天水提取物小、中、大剂量组的精子顶体完整率均显著低于正常组。但高于模型组(均P<0.001)；巴戟天水提取物中、大剂量组的精子顶体完整率显著高于VitC组(P<0.05，P<0.001)，见表1。
2.2 精子顶体超微结构观察
透射电镜观察，正常组精子形态正常，顶体超微结构完
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