地黄饮子含药脑脊液对AB25-35诱导的PCI2细胞损伤凋亡基因bax bck-2和caspase-(1)
摘要：目的：探讨古方地黄饮子对B淀粉样蛋白(AB25-35)所致PCI2细胞损伤时凋亡基因bax、bcl-2和caspflse-3表达的调控作用。方法：把离体培养的进入对数生长期的PCI2细胞分为6组：空白对照组、模型对照组、VitE脑脊液组、地黄饮子脑脊液低、中、高剂量组。待24h细胞贴壁后吸去培养液，分别加入空白培养液、正常脑脊液、VitE脑脊液、中药脑脊液低、中、高剂量，加培养液补至等量，370C孵育2h。然后除空白组之外的各组加入经老化处理的AB25—35(终浓度为10μmol/L)，建立AD细胞模型。空白组加入等量的培养液，继续孵育24h后离心收集细胞，提取总RNA。应用RT-PCR二步法和琼脂糖凝胶电泳方法测定bax、bcl-2和caspase-3基因的表达。结果：地黄饮子能下调bax、caspase-3基因的表达，对bcl-2基因的表达有上调作用。结论：地黄饮子脑脊液能有效降低bax、easpase-3基因表达，提高bcl-2的表达，从而抑制、延迟细胞凋亡过程，阻止细胞凋亡，促进PC12细胞存活。
关键词：地黄饮子；脑脊液；PC12细胞；细胞凋亡
, 百拇医药
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)09-1770-04
1 材 料
1.1 细胞及动物PC12细胞购自中科院上海生物细胞研究所。大耳白家兔，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
1.2 药物组成：地黄饮子由熟地、山萸肉、肉苁蓉、石斛、麦冬、五味子、石菖蒲、远志、茯苓、肉桂、炮附子、巴戟天、薄荷等组成。(由哈尔滨市松茂药行提供)
1.3 主要药品及试剂：Aβ25-35(sigma)，DMEM培养基、胰蛋白酶(Hyclone)，5%胎牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)，VitE(大连南美制药有限公司)，引物、DNAmarcker(大连宝生物)，中药饮片由黑龙江中医药大学提供。
1.4 主要实验仪器：稳压稳流电泳仪：DYY-8，上海琪特分析仪器有限公司。紫外凝胶成像系统：Labworks 4.5UVP Ltd. Cambridge，UK。PCR扩增仪：Apllied Biosysems2700 PE，Singatpore。
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2 方 法
2.1 PC12细胞的培养方法，PC12细胞培养于含10%胎牛血清(56℃灭活30 min)DMEM的培养液中，并加入100U/mL链霉素，100U/mL青霉素。细胞接种于培养瓶中，在37℃，5%CO2/95%空气，饱和湿度的培养箱中培养。2天换液1次，三四天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
2.2 中药脑脊液的提取方法：2kg重大耳白家兔，适应性喂养3天，灌胃给服地黄饮子水煎剂、VitE(0.21g/mL，吐温80助溶于蒸馏水中)水溶液，灌服药量均按成人量10倍给药，空白组给服等体积的蒸馏水。灌胃后1h，戊巴比妥钠静脉麻醉，于无菌条件下在枕骨大孔处垂直进针，抽取200μL脑脊液，并补充等量等生理盐水，以上步骤连续3天，把3天获得的同一家兔的脑脊液混合，-70℃冻存备用。
2.3 实验分组及AD细胞模型的建立，离体培养进入对数生长期的PC12细胞分为6组：空白对照组(简称空白组)、模型对照组(简称模型组)、VitE组(简称西对组)、地黄饮子低剂量组(简称中低组)、地黄饮子中剂量组(简称中中组)、地黄饮子高剂量组(简称中高组)。待24h细胞贴壁后吸去培养液，分别加入空白培养液10%、正常脑脊液10%、VitE脑脊液10%、中药脑脊液低剂量5%、中剂量10%、高剂量20%。加培养液补至等量，37℃孵育2h。然后除空白组之外的各组加入经老化处理的AB25-35(终浓度为101μmol/L)，建立AD细胞模型。空白组加入等量的培养液，继续孵育24h后将细胞吹打至悬浮状，离心收集细胞，提取总RNA。
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2.4 RT-PCR检测bax bel-2和caspase-3基因的表达
采用Trizol提取RNA。逆转录体系参照RT-PCR二步法(Advantage?RT-for-PCR Kit，Clontech)。引物设计由美国NCBl数据库提供RNA全序列，用primer3引物设计软件设计。
Rat bax：left primer：5`GGCGATGAACTGGACAAC 3`，right primer：5`CCGAAGTAGGAAAGGAGGC 3`(产物为299bp)；
Rat Bcl-2 left primer： 5`GGCATCTTCTCCTTCCAG3`，right primer：5`CATCCCAGCCTCCGTTAT 3`(产物为442bp)；
Rat Caspase-3：left primer：5`CTGGACTGCGGTATTGAG 3`，right primer：5`GGAACATCGGATTTGATT 3`(产物为489bp)；
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β-actm：left pnmer：5`TGTGATGGTGGGTATGGG 3`，right pnmer：5`TAGAAGCATITGCGGTGC 3`(产物为500bp)。
聚合酶链式反应(PCR)条件：cDNA 2.0μL，dNTP 2.0μL，10×RT buffer2.5μL，上下游引物(20μmol/L)各0.5μL，Taq酶0.25μL，加去离子水至25μL。反应参数：95℃2min；94℃1min，55℃45S，72℃45S，25个循环；74℃延伸10 min。β-aetin的反应参数为95℃5min；94℃1 min，55℃1min，74℃min，25个循环；74℃延伸10min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳下分离检测。凝胶成像分析系统进行拍照和分析扩增产物电泳强度，以上实验重复3次。
3 结 果
(1)地黄饮子含药脑脊液对PC12细胞bax基因表达的调控作用。
, http://www.100md.com
(2)地黄饮子含药脑脊液对PC12细胞bcl-2基因表达的调控作用。
(3)地黄饮子含药脑脊液对PC12细胞csapase-3基因表达的调控作用。
4 讨 论
老年性痴呆(简称AD)是发生于老年期和老年前期的一种以进行性痴呆为特征的脑慢性退行性疾病，临床主要变现为记忆力减退、智能障碍及行为情绪等的异常改变。其发生机制的细胞凋亡学说研究中，细胞培养，动物模型以及患者的尸均证实了AD病机中的细胞凋亡。自由基.基因突变，钙稳态失衡尤其是Aβ的神经毒性都可能触发神经细胞的调亡。
PC12细胞(Pheochromocytoma cells)为大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆化的细胞株，系神经峭源性。具有较典型的神经内分泌细胞特性，而且易培养，可传代。已广泛用, http://www.100md.com(谢 宁 姚辛敏 孟 菲 周妍妍 何秀丽)
关键词：地黄饮子；脑脊液；PC12细胞；细胞凋亡
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中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)09-1770-04
1 材 料
1.1 细胞及动物PC12细胞购自中科院上海生物细胞研究所。大耳白家兔，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
1.2 药物组成：地黄饮子由熟地、山萸肉、肉苁蓉、石斛、麦冬、五味子、石菖蒲、远志、茯苓、肉桂、炮附子、巴戟天、薄荷等组成。(由哈尔滨市松茂药行提供)
1.3 主要药品及试剂：Aβ25-35(sigma)，DMEM培养基、胰蛋白酶(Hyclone)，5%胎牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)，VitE(大连南美制药有限公司)，引物、DNAmarcker(大连宝生物)，中药饮片由黑龙江中医药大学提供。
1.4 主要实验仪器：稳压稳流电泳仪：DYY-8，上海琪特分析仪器有限公司。紫外凝胶成像系统：Labworks 4.5UVP Ltd. Cambridge，UK。PCR扩增仪：Apllied Biosysems2700 PE，Singatpore。
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2 方 法
2.1 PC12细胞的培养方法，PC12细胞培养于含10%胎牛血清(56℃灭活30 min)DMEM的培养液中，并加入100U/mL链霉素，100U/mL青霉素。细胞接种于培养瓶中，在37℃，5%CO2/95%空气，饱和湿度的培养箱中培养。2天换液1次，三四天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
2.2 中药脑脊液的提取方法：2kg重大耳白家兔，适应性喂养3天，灌胃给服地黄饮子水煎剂、VitE(0.21g/mL，吐温80助溶于蒸馏水中)水溶液，灌服药量均按成人量10倍给药，空白组给服等体积的蒸馏水。灌胃后1h，戊巴比妥钠静脉麻醉，于无菌条件下在枕骨大孔处垂直进针，抽取200μL脑脊液，并补充等量等生理盐水，以上步骤连续3天，把3天获得的同一家兔的脑脊液混合，-70℃冻存备用。
2.3 实验分组及AD细胞模型的建立，离体培养进入对数生长期的PC12细胞分为6组：空白对照组(简称空白组)、模型对照组(简称模型组)、VitE组(简称西对组)、地黄饮子低剂量组(简称中低组)、地黄饮子中剂量组(简称中中组)、地黄饮子高剂量组(简称中高组)。待24h细胞贴壁后吸去培养液，分别加入空白培养液10%、正常脑脊液10%、VitE脑脊液10%、中药脑脊液低剂量5%、中剂量10%、高剂量20%。加培养液补至等量，37℃孵育2h。然后除空白组之外的各组加入经老化处理的AB25-35(终浓度为101μmol/L)，建立AD细胞模型。空白组加入等量的培养液，继续孵育24h后将细胞吹打至悬浮状，离心收集细胞，提取总RNA。
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2.4 RT-PCR检测bax bel-2和caspase-3基因的表达
采用Trizol提取RNA。逆转录体系参照RT-PCR二步法(Advantage?RT-for-PCR Kit，Clontech)。引物设计由美国NCBl数据库提供RNA全序列，用primer3引物设计软件设计。
Rat bax：left primer：5`GGCGATGAACTGGACAAC 3`，right primer：5`CCGAAGTAGGAAAGGAGGC 3`(产物为299bp)；
Rat Bcl-2 left primer： 5`GGCATCTTCTCCTTCCAG3`，right primer：5`CATCCCAGCCTCCGTTAT 3`(产物为442bp)；
Rat Caspase-3：left primer：5`CTGGACTGCGGTATTGAG 3`，right primer：5`GGAACATCGGATTTGATT 3`(产物为489bp)；
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β-actm：left pnmer：5`TGTGATGGTGGGTATGGG 3`，right pnmer：5`TAGAAGCATITGCGGTGC 3`(产物为500bp)。
聚合酶链式反应(PCR)条件：cDNA 2.0μL，dNTP 2.0μL，10×RT buffer2.5μL，上下游引物(20μmol/L)各0.5μL，Taq酶0.25μL，加去离子水至25μL。反应参数：95℃2min；94℃1min，55℃45S，72℃45S，25个循环；74℃延伸10 min。β-aetin的反应参数为95℃5min；94℃1 min，55℃1min，74℃min，25个循环；74℃延伸10min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳下分离检测。凝胶成像分析系统进行拍照和分析扩增产物电泳强度，以上实验重复3次。
3 结 果
(1)地黄饮子含药脑脊液对PC12细胞bax基因表达的调控作用。
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(2)地黄饮子含药脑脊液对PC12细胞bcl-2基因表达的调控作用。
(3)地黄饮子含药脑脊液对PC12细胞csapase-3基因表达的调控作用。
4 讨 论
老年性痴呆(简称AD)是发生于老年期和老年前期的一种以进行性痴呆为特征的脑慢性退行性疾病，临床主要变现为记忆力减退、智能障碍及行为情绪等的异常改变。其发生机制的细胞凋亡学说研究中，细胞培养，动物模型以及患者的尸均证实了AD病机中的细胞凋亡。自由基.基因突变，钙稳态失衡尤其是Aβ的神经毒性都可能触发神经细胞的调亡。
PC12细胞(Pheochromocytoma cells)为大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆化的细胞株，系神经峭源性。具有较典型的神经内分泌细胞特性，而且易培养，可传代。已广泛用, http://www.100md.com(谢 宁 姚辛敏 孟 菲 周妍妍 何秀丽)