绞股蓝总皂苷对糖尿病肾病大鼠结缔组织生长因子表达的影响(1)
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摘要：目的：为探讨CTGF在糖尿病肾病发生中的作用，寻找有效的干预药物，观察绞股蓝总皂苷对糖尿病肾病大鼠肾脏CTGF表达的影响。方法：采用肾脏病理形态以及免疫组织化学检查对糖尿病肾病模型大鼠肾脏中CTGFmRNA含量的测定，分析绞股蓝皂苷改善肾功能的机制。结果：病理切片示各造模组大鼠肾小球系膜区细胞外基质呈不同程度的积聚。和正常大鼠(F组)相比，各组CTGFmRNA含量均增高；各给药组(A、B、c、D组)CTGFmRNA的蛋白表达较模型组(E组)降低；D组对CTGFmRNA蛋白表达的降低作用与B组相似。结论：绞股蓝皂苷能明显抑制实验性糖尿病肾病大鼠CTGF表达，从而减少肾小球系膜区ECM的积聚。
关键词：绞股蓝总皂苷；糖尿病肾病；结缔组织生长因子；细胞外基质
中图分类号：R-33 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)11-2235-04
糖尿病在我国发病率呈快速上升趋势，慢性并发症是其致死和致残的主要原因。糖尿病肾病(DN)成为慢性肾功能不全和终末期肾衰需要血液透析的常见原因。DN以肾小球细胞外基质聚集、肾小球硬化及进展性小管间质纤维化为特征，但其发病机制未完全明了。纤维化是糖尿病慢性并发症的主要病理特征之一。为探讨CTGF在糖尿病肾病发生中的作用，寻找有效的干预药物，本研究观察了绞股蓝总皂苷对糖尿病肾病大鼠肾脏CTGF表达的影响。
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1 材料与方法
1.1 动物造模与分组60只SD大鼠中随机选取54只，按杨俊伟等单侧肾切除加STZ注射法改良复制DN模型，以血糖大于16.7mmol/L、尿糖阳性(++～++++)、尿量大于对照组的50%者为模型复制成功。将糖尿病肾病模型大鼠按性别、体重随机分为5组，每组8只，即绞股蓝皂苷高剂量组(A组：1g/kg)；中剂量组(B组：0.5g/kg)；低剂量组(C组：0.25g/kg)；人参皂苷Rb1组(D组：0.01mg/kg)；模型对照组(E组：灌胃等体积的生理盐水)。各组大鼠灌胃给药，1日1次，连续4周；正常对照组(F组)也灌胃等体积的生理盐水。
各组大鼠分别于治疗第4周末颈椎脱臼处死，提前1天以代谢笼留取24h尿液标本，用于测定尿肌酐和尿蛋白；同时取血测空腹血糖、血肌酐和尿素氮。取出右肾，去除肾脏被膜后称重，计算肾重/体重；冠状面纵切肾脏，肾皮质放人10%中性甲醛溶液中固定，用于组织形态学及免疫组织化学检查。
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1.2 肾脏病理检查所有标本按常规方法固定，包埋，连续切片，超薄切片机将胰组织切成3μm厚，供HE染色、PAS染色。在高倍镜下按顺序观察每张切片皮质部分肾小球的改变。
1.3 RT-PCR采用Trizol试剂(由美国GIBCOBRL公司提供)一步法提取总RNA，逆转录成cDNA(invitrogen逆转录试剂盒)。以适量cDNA为模板，在TaqDNA聚合酶催化下进行，引物序列CTGF：F：5’-GGCCCTGCCCTAGCTGC-CTA-3’T m=68.0 R：5’-TGGAGATGCCCATCCCA-CAG-3’Tm=66.7扩增长度：130bp GAPDH：F：5’-GTCGGTGTGAACGGATFr-3Tm=56.8 R：2.5’-ACTC-CACGACGTACTCAGC-3’ Tin=56.3扩增长度：276bp，以GAPDH作内参对照。反应条件为：cDNAT0℃预变性2min，扩增：CTGF：先在94℃变性3min，然后按下述条件循环35次：变性94℃10s、退火66℃20s、延伸72℃20s，最后72℃延伸10min，4℃冷却5mln结束反应。GAPDH：94℃变性5min，然后按下述条件循环28次：变性94℃1min、退火54℃45s、延伸72℃2min，最后72℃延伸10min，4℃冷却5min结束反应。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统进行分析，以待测指标分析，GAPDH作为所有标本的RT-PCR阳性对照。
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1.4 统计学分析采用SPSS11.0软件统计。实验结果以均以均值±标准差(x±s)表示，组间差异采用t检验方法，以P
2.3 各组大鼠肾组织中CTGFmRNA表达的比较和正常大鼠相比，各组DN大鼠CTGFmRNA的表达均增高；治疗组(A、B、C、D组)CTGFmRNA的表达较对照组(E组)降低；D组对CTGFmRNA的降低作用与B组相似。表明绞股蓝总皂苷与人参皂苷Rb1具有降低CTGFmRNA的作用。具体见图13、图14(半定量分析结果表2)。
3 讨论
结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CT-GF)是CCN家族的一种生长调节因子，近年来，随着认识深入，其在肾小球硬化和肾间质纤维化中的作用越来越受到关注，Igarashi等证实在许多以纤维化为主要特征的疾病中，CTGFmRNA表达水平明显上调。在生理状态下，肾小球壁层、脏层上皮细胞，肾间质成纤维细胞和管周毛细血管内皮细胞等均可分泌少量CTGF。在某些病理状态下，特别是在伴有细胞增生和ECM合成的肾小球系膜和小管间质病变区，鼠或人的肾系膜细胞表达CTGFmRNA明显增加，糖尿病肾病就属于这种增生性肾脏病理改变。在本实验中可以明显发现，各组模型大鼠的肾系膜细胞表达CTGFmRNA明显增加。Riser等发现DN早期系膜CTG-FmRNA水平即明显增加，更加说明CTGF在肾小球硬化早期发挥了重要作用。
CTGF作为TGF—B下游信号介质能刺激细胞增殖并特异性介导ECM聚集纤维化作用。而糖尿病肾病的主要病理特点是ECM过度积聚，这点与本实验病理切片结果一致。因而，笔者认为TGF—B—CTGF—ECM之间存在着密切的联系。TGF—B可诱导多种细胞分泌CTGF，反过来CTGF又可以作用于相关细胞，参与TGF-β对这些细胞的增生和ECM合成作用。在体外细胞培养实验中，应用特异性抗CTGF抗体或CTGF反义寡核苷酸探针，可有效抑制, 百拇医药(黄 平 钱 康)