滋肾解毒中药对Ⅳ型狼疮肾炎血清诱导肾小球系膜细胞增殖凋亡及纤维连接蛋白核酸表达的影响(2)
 |
 |
 |
 |
 |
 |
(2)逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)：MMLV逆转录成eDNA。分别加入FN及β-Aetin引物，PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，用FR-200生物电泳图像分析系统摄影、Bandsean5.0软件分析产物光密度，进行FNmRNA及β-Aefin mRNA表达分析，并计算FNmRNA/Aetin mR-NA比值。
①引物序列：应用生物信息学知识，从Genebank中查阅出FN及内参基因β-aetln的mRNA序列，根据引物设计原则，并利用Primer Express 2.0设计软件，设计出扩增各基因片段的引物。引物序列见表1。
②eDNA合成：将反应体系(RNA 2ug、下游引物15pmoL、DEPC水使最终反应体积为25uL)在70℃预变性5min，立即放于冰上，加入5×RTBuffer 5uL、lOmmoL dNTPs1.5trL、RNasin 25U、M-MLV 200U；反应条件：37℃1h，95℃5rain灭活逆转录酶。
③常规RT-PCR扩增各基因mRNA：反应体系：10×PCR Buffer 5uL 10mmol dNTPsluL，上、下游引物各15pmol、Taq酶3U、以上逆转录eDNA5uL。加无菌去离子水至50uL。反应条件：93℃3min预变性，93℃30s，60℃30s，72℃ 45s ......
您现在查看是摘要页，全文长 5331 字符。