益气补肾口服液体外抗肿瘤作用的实验研究
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摘 要：目的：研究益气补肾口服液的体外对SMMC-27721细胞及A-549细胞生长抑制作用。方法：采用活细胞计数法及MTT法观察益气补肾口服液对上述两种人瘤细胞进行检测和观察。结果：益气补肾口服液对上述两种人瘤细胞的生长增殖曲线具有明显的抑制作用。对两种人瘤细胞降解MTT半数抑瘤浓度(IC50)分别为1.02mg/mL、0.73mg/mL；对两种人瘤细胞的集落形成有明显的抑制作用，最大抑制率分别为78.48%、89.17%。结论：益气补肾口服液体外具有明显的抗肿瘤活性。
关键词：益气补肾口服液；SMMC-27721细胞 ；A-549细胞；生长抑制
中图分类号：R273
文献标识码：A文章编号：
1673-7717(2008)11-2445-02
, 百拇医药
An Experimental Study on Anti-tumor Effects of Yiqi Bushen Liquid in Vitro
RUAN Yeping, HU Xiumin(Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,Zhejiang,China)
Abstract：Objective：To investigate the anti-tumor effects of Yiqi Bushen liquid on homo sapien hepatoma carcinoma cells, SMMC-27721, and homo sapien lung carcinoma cells, A-549 in vitro.Methods：Viable cells count，MTT staining assay were used to assess the anti-tumor effects of Yiqi Bushen liquid on the two kind cells. Results：Yiqi Bushen liquid had a certain inhibitory action on growth curve of SMMC27721 and A549 cells.The IC50of the two cells were 1.02mg/mL and 0.73mg/mL respectively. It also could inhibit the two cells forming colonies. The highest inhibitory rate of Yiqibushen liquid against SMMC27721 and A549cells were 78.48% and 89.17% respectively.Conclusion：Yiqi Bushen liquid have strong anti-tumor effects in vitro.
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Key words：Yiqi Bushen liquid;SMMC-27721 cells;A-549 cells;growth inhibiting
益气补肾口服液根据肿瘤手术、化疗、放疗后正气亏虚之病机特点而组方，由黄芪、茯苓、女贞子、枸杞子、猪苓、莪术、半枝莲等组成，具有补气固表、滋补肝肾、利水渗湿、活血止痛、败毒抗癌等功效。笔者已经研究表明，益气补肾口服液具有较好的体内抗肿瘤作用(另文报道)，现对其体外抗肿瘤作用的实验研究报道如下，为临床用药提供实验依据。
1 实验材料
细胞株：人肝癌SMMC-27721细胞株、人肺癌A-549细胞株均由浙江大学医学院提供提供。益气补肾口服液的处方：黄芪20g，茯苓12g，女贞子12g，枸杞子12g，猪苓12g，莪术10g，半枝莲30g，藤梨根30g，生米仁30g，八月札10g，红枣30g，炙甘草6g。将药放入锅中浸泡1h，加水煎煮1h，滤出药液，再加水煎煮30min，过滤，合并药液，浓缩药液分别至4.28g/mL、2.14g/mL、1.07g/mL3个浓度，分别作为高、中、低3个剂量组的给药浓度。MTT试剂(美国Sigma)，RPMI1640细胞培养液(日本日水制药株式会社)，小牛血清购于杭州四季青生物工程材料研究所，批号20060326。倒置显微(Nikon808434)，CO2培养箱(日本Forma)，酶标仪(Lab systems Dragon wells can MK3)。
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2 方法及观测指标
2.1 益气补肾口服液对两种瘤细胞生长曲线的影响[1]
①细胞培养：5%CO2培养箱，用含10%小牛血清及青、链霉素各1×105U/L的RPMI 1640培养基培养，收集对数生长期细胞进行实验。②采用细胞排染实验计细胞死亡数：选取对数生长期的两种人肿瘤细胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液稀释至浓度约1×104/mL，均匀加入24孔培养板，每孔1mL，按实验设计分别加益气补肾口服液药液及阴性对照组加入等体积的溶剂，每浓度设21复孔。置于37℃饱和湿度、5%CO2培养箱中，在培养后即刻及1、2、3、4、5、6、7天各取3孔，加入0.4%台盼蓝液10μL，计数拒染的活细胞数后取其平均值。依据活细胞数与时间作用关系绘生长曲线。两种人癌细胞生长速度及死亡率测定结果，见图1~4，从图1~4提示益气补肾口服液能抑制肝癌、肺癌细胞生长增殖，增强杀伤效果，促进细胞死亡。
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2.2 MTT法测益气补肾口服液对两种人肿瘤细胞细胞增殖的影响[1]
分别取对数生长期的两种肿瘤细胞，以RPMI-1640培养液稀释至浓度约1×104个/mL的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔200μL，置含5%CO2的37℃细胞培养箱中，培养24h后，吸出培养液，按实验设计分别加入含不同药物浓度的培养液，同时设立空白对照组加入等体积的培养液，每浓度设4个复孔，培养72h后，弃去上清液，每孔加入200μL MTT(2g/L)，震荡混匀后，继续孵育4h，小心弃去上清液，加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，平板振荡仪振荡10min，在酶标仪上用波长570nm，处测其吸光度(OD)值，计算细胞抑制率。其公式为：细胞抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。剂量和效应关系用直线回归分析和相关分析求半抑制率(IC50)。
按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：
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肿瘤细胞生长抑制率=(1-实验组平均OD值/对照平均OD值)×100%。
结果见表1~2。结果可见，益气补肾口服液对人肝癌SMMC-7721、人肺癌A549细胞有直接杀伤作用，且对两种人肿瘤细胞株的抑制作用与浓度成正比，其IC50分别为1.02、0.73mg/mL。
3 讨论
肿瘤是当前对人类健康的最大威胁之一，全世界每年有700万癌症新患者，我国每年有160万新发患者，105万人死于此疾，其发病率和死亡率仍呈逐年上升。病因学研究发现，肿瘤的发生与生活环境、饮食结构、病毒及生物等有关，但其详细的发病原因还不是十分清楚，临床仍采取手术放疗为主、化疗为辅的治疗措施，但目前临床使用的抗肿瘤药物主要有细胞毒类、生物反应调节剂等，这些药物由于作用环节单一、毒副作用大，限制了其应用范围。近年来中医药在治疗肿瘤方面已取得了较大的进展，进行了大量的临床和实验研究，充分体现了其优势和特点，以其毒副作用小、作用温和、疗效显著等特点受到了世界医学界的广泛关注，具有较大的开发潜力，尤其是中药在提高人体免疫功能，改善胃肠功能及睡眠，增强人体抗病能力，提高患者生存质量方面具有不可替代的作用。
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本实验结果表明，益气补肾口服液体外对人肝癌SMMC27721细胞及人肺癌A549细胞具有明显的抑制作用。益气补肾口服液为中药复方制剂，根据祖国医学的君臣佐使理论，经多年临床应用研制而成。本实验中所用的益气补肾口服液含有多种有效成分，其中滕梨根为主要药物，《河北中草药》言：“能清湿热、利黄疸、且有促进食欲，畅通乳络之功。适用于湿热黄疸、消化不良及乳汁不下等症。能祛风除湿、消痈医疡，适用于风湿痹痛、关节肿痛，以及疔疮、痈疮，跌打损伤等症。有抗癌作用，疗效较佳”。目前有关滕梨根多糖复合物的抗肿瘤作用已有报道[2]。另外方中黄芪、茯苓、女贞子、枸杞子、猪苓、莪术、半枝莲、藤梨根、生米仁、八月札等药物，经现代药理学研究表明均具有抗肿瘤作用[3]。其中有些中药已开发为中药抗肿瘤新药，如猪苓多糖、康莱特、黄芪多糖等等。其抗肿瘤作用机制笔者将做进一步研究。
参考文献
[1] 刘建文.药理实验方法学新技术与新方法[M].北京:化学工业出版社，2003：25-27.
[2] 吴雄志.多糖抗肿瘤机理研究进展[J].中国中医基础杂志,2001,7(12):675.
[3] 李忠.临床中医肿瘤学[M].沈阳:辽宁科学技术出版社,2002：255-310., http://www.100md.com(阮叶萍 胡秀敏)