用蛋白芯片技术筛选膝骨性关节炎不同中医证型患者血清中标志蛋白(1)
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摘要：目的：利用蛋白芯片技术和生物信息学方法从膝骨性关节炎患者血清中筛选标志蛋白质。方法：采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(surfaced enhanced laser desorpfion/ion/zafion time of flight mass spec-troscopy)和弱阳离子交换(CMIO)蛋白芯片对30例肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者、35例气滞血瘀型膝骨性关节炎患者血清和40例健康者血清的蛋白质谱图进行了检测，获得的蛋白质谱采用Ciphergen公司的Biomarker Wiz-ard和Biomarker Pattern软件分析。结果：肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者与健康者血清蛋白质谱相比有18个显著差异蛋白质(P<0.01)，其中13个蛋白质在患者血清中高表达，5个蛋白质在患者血清中低表达。气滞血瘀型膝骨性关节炎患者与健康者相比有20个显著差异蛋白质(P<0.01)，其中6个蛋白质在患者血清中高表达，14个蛋白质低表达。肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者与气滞血瘀型膝骨性关节炎患者相比有5个显著性差异蛋白(P<0.01)。结论：实验证明利用蛋白质组学和生物信息学方法可以从血清中筛选出膝骨性关节炎中医证型相关的标志蛋白质，而且蛋白质芯片技术对于发现和筛选血清中的膝骨性关节炎标志蛋白质是一种有效、快速的工具。
关键词：膝骨性关节炎；中医证型；蛋白芯片
中图分类号：R684.3 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2009)05-0934-03
膝骨性关节炎中国传统医学称为“膝骨痹”，源于《内经》“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，名日骨痹”。膝骨痹病名最早见于孙思邈《备急千金要方》。膝骨痹由于年老体衰，骨失滋养，气血失调，致局部或全身骨关节退化改变。临床表现以大关节疼痛、活动受限为主症。膝骨性关节炎是多因素性疾病，病因较为复杂。本研究采用表面增强激光解离飞行时间质谱技术(surface-enhancedlaser desorp-tion/ionization time of ftighl mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)。运用CM10蛋白质芯片对膝骨性关节炎患者按中医证型进行研究。探索其血清中的蛋白质指纹图谱，希望发现一些特异性的差异蛋白，从而对膝骨性关节炎的病因、诊治有所帮助。
1 对象与方法
1.1 临床资料
1.1.1 一般资料 65例患者均为台州市立医院骨科住院与门诊常规中医辨证治疗的膝骨性关节炎患者，其中30例为肝肾亏虚者，35例为气滞血瘀者。健康者40例，均为体检正常的健康志愿者。血清分离后储存于-80℃低温冰箱中。
1.1.2 诊断标准 ①近1个月内经常反复膝关节疼痛；②X线(站立或负重位)，关节间隙变窄、软骨下骨硬化或囊性变、关节缘骨赘形成；③关节液(至少抽取2次)清亮、黏稠，WBC<2000个/mL；④中老年者(≥45岁)；⑤晨僵时间≤30min；⑥膝关节活动时有摩擦音。根据临床表现、实验室及X线检查，符合①②或①③⑤⑥或①④⑤⑥，即可诊断膝骨性关节炎。
1.1.3 中医分型 ①肝肾亏虚：关节隐隐作痛，腰膝酸软，腰腿不利，俯仰转侧不利。伴有头晕，耳鸣，耳聋，目眩，舌淡红，苔薄白，脉细。②气滞血瘀：关节刺痛，痛处固定，关节畸形，活动不利，或腰弯背驼，面色晦暗，唇舌紫黯，脉沉或细涩。
1.1.4 纳入标准 ①符合膝骨性关节炎西医诊断标准者；②符合膝骨性关节炎中医辨证诊断标准属气滞血瘀、肝肾亏虚证者；③45岁以上患者；④4周内未作糖皮质激素及其他口服药物治疗者。
1.1.5 排除标准 ①不符合上述诊断标准者；②中医证候分类不属“气滞血瘀、肝肾亏虚”型者；③年龄小于45岁者；④4周内使用糖皮质激素及其他口服药物治疗者；⑤合并严重心脑血管、肝、肾、造血系统疾患者；⑥孕妇；⑦合并类风湿关节炎、痛风、关节结核、化脓性关节炎、大骨节病者。
1.2 研究方法
1.2.1 仪器和芯片 蛋白质芯片阅读机为PBS-IIC型SELDI-TOF-MS系统，芯片选用CM10蛋白质芯片(美国BIO-RAD生物公司)。
1.2.2 样本处理 血清标本冰浴溶解后在40℃ 10000r/min离心10min，取10μL加入预先配置好的20μLU9[9mol/L尿素，2%(体积分数)s-环乙氨-1-丙磺酸，50mmol/L Tris盐酸，pH9.0]，4℃振荡反应30min，2000r/min离心5min取上清液10μL，快速加入110wL结合缓冲液(50mmol/LNaAc，pH4.0)。取出芯片每孔加入200μL的结合缓冲液，室温下400～600r/min震荡5min，甩去缓冲液，重复1次。取处理好的血清100μL上样到芯片处理器，4℃400～600r/min震荡1h，甩出样品，每孔加入200μL的结合缓冲液室温下400～600r/min震荡5min，甩去孔中液体重复操作1次。每孔加入200μL高纯去离子水，立即甩出后，即刻拆开芯片处理器，取出芯片，待干后每孔加入能量吸收物质[50%(体积分数)乙腈+0.5%(体积分数)三氟乙酸]0.5μL到已经结合上蛋白质的CM10芯片上，重复加能量吸收物质0.5μL1次，上机检测。
1.2.3 数据采集 蛋白质芯片采用蛋白质芯片阅读机PBSU-c型读取数据。仪器每天用标准多肽和低于200kD的蛋白质标准分子校正，系统的质量偏差为0.1%。检测芯片时蛋白质芯片阅读机设置如下：激光强度195，检测敏感度8，优化分子质量范围2～20kD，最高分子量150kD，每个样品收集64个点。获取蛋白指纹图谱。
1.2.4 生物信息学方法分析采用Ciphergen proteinehlp3 ......
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