柔肝抑纤饮联合二至丸逆转DMN大鼠肝窦毛细血管化的对比研究(1)
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摘要：目的：探讨中药复方柔肝抑纤饮联合二至丸在抗大鼠肝窦毛细血管化方面与单独使用柔肝抑纤饮有无差别，明确联合二至丸后对原方有无增效、协同作用，并阐明其机制。方法：建立大鼠DMN肝纤维化模型，随机分4组：A组(正常组)、B组(模型组)、C组(柔肝抑纤饮组)、D组(柔肝抑纤饮+二至丸组)，分别灌服相应药物。检测血清HA、Col-Ⅳ，行胶原染色(Masson)，免疫组化染色观察并测定肝组织CD44、vWF、MMP-2、MMP-9的表达，电镜观察窦周隙超微结构。结果：D组与C组在降低HA含量、Masson染色百分比以及改善CD44和MMP-9免疫组化染色阳性面积均值等方面均明显优于B组(P<0.05，P<0.01)，但D组与C组比较未见显著性差异(P>0.05)。D组在降低Col-Ⅳ、MMP-2和vWF免疫组化染色阳性面积均值等方面，作用明显优于C组(P<0.05)；电镜观察发现，D组肝窦内皮失窗孔和内皮下连续性基底膜的形成等病变也相对较轻。结论：联合二至丸能使柔肝押纤饮抗肝窦毛细血管化的作用得以增强，提高疗效。
关键词：柔肝押纤饮；二至丸；肝窦毛细血管化；肝纤维化；实验研究
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2009)05-1008-03
柔肝抑纤饮是笔者在总结以往实践经验及肝病证治规律的基础上，结合现代药理学研究成果制订的中药复方，具有养血柔肝、活血通络之功，用于治疗慢性肝炎及早期肝硬化疗效显著。前期研究表明：该复方对小鼠血吸虫性肝纤维化和大鼠CCl4所致的肝纤维化都具有一定的抑制和降解作用。本实验将该方与二至丸合用，探讨柔肝抑纤饮联合二至丸在抗大鼠肝窦毛细血管化方面与单独使用柔肝抑纤饮有无差别，明确加用二至丸后对原方有无增效、协同作用，并阐明其机制。
1 材料
1.1 动物
SPF级雄性Wistar大鼠48只，体重(150±20)g，随机分为：A组(正常组)、B组(模型组)、C组(柔肝抑纤饮组)、D组(柔肝抑纤饮+二至丸组)，每组12只，分笼饲养。
1.2 药品
柔肝抑纤饮浓缩水煎剂：鸡血藤、当归、杭芍、川牛膝、鳖甲、枸杞等，水煎浓缩，药物浓度为127%(生药含量1.23g/mL)。
“柔肝抑纤饮+二至丸”浓缩水煎剂：柔肝抑纤饮原方加女贞子、旱莲草，水煎浓缩，药物浓度为147%(生药含量1.473g/mL)。
二甲基亚硝胺溶液：二甲基亚硝胺(dimethylnitro-samine，DMN)，美国Sigma—AldriCh公司产品，Lot，101K01821。使用时配成0.5%(1:199生理盐水稀释)的溶液备用。
1.3 试剂
兔抗大鼠CD44多克隆抗体、兔抗大鼠第Ⅷ因子相关抗原(yon willCbrand faCtor，vWF)多克隆抗体为美国AbCam公司产品，二抗试剂盒购自晶美生物公司；兔抗大鼠MMP-2、MMP-9多克隆抗体及SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程公司。
2 方法
2.1 造模
除A组外，B、C、D组每鼠按2mL/kg剂量腹腔注射0.5%DMN溶液，每天1次，每周连续3天，共4周。正常组给以生理盐水腹腔注射，注射方法、剂量同B组。注射后将大鼠放回各组所在的鼠笼，正常饲养。
2.2 分组给药
造模成功后开始灌服药物。C组每天灌服柔肝抑纤饮浓缩水煎液，D组每天灌服柔肝抑纤饮+二至丸浓缩水煎剂，灌胃剂量均为13.6mL/kg，A、B两组分别灌服等量的生理盐水，连续14天。于实验第43天，最后1次灌胃后，各组动物均禁食不禁水，分别随机抽取8只大鼠，24h后采血，处死，剖取肝组织备检。
2.3 检测指标
2.3.1 血清肝纤维化指标 采用上海海研医学生物技术中心提供的试剂盒放射免疫分析法测定血清透明质酸(HA)和Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)含量。
2.3.2 Masson染色观察 每张切片采集5个光镜视野，输入HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统内，选择胶原纤维占整屏视野的百分比含量均值参数进行计算机定量分析(软件包为武汉同济医科大学千屏影像工程公司商业提供)。
2.3.3 透射电镜观察 各组随机抽取2只动物，取1mm3的肝组织块制做电镜标本，日本电子JEM-1200EX透射电镜观察窦周隙超微结构。
2.3.4 免疫组化染色 行CD44、vV/F、MMP-2、MMP-9免疫组化染色，染色过程中分别设阳性对照和阴性对照，阴性对照以PBS替代I抗，DAB显色。选择积分光密度均值参数进行计算机定量分析(软件包为武汉同济大学千屏影像工程公司商业提供)。每张切片于10倍的光镜下选择阳性细胞较多的区域采集5个视野，输入HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统内，在相同的背底倍体条件下，选择相应的参数进行计算机完全定量分析，测定标准测量窗口中肝窦壁阳性区域的面积比(软件包为武汉同济医科大学千屏影像工程公司商业提供)。
2.4 统计学处理
应用SPSS14.0软件进行统计运算，数据以均数±标准差(x±s)表示，采用ANOVA程序进行单因素方差分析，并用LSD程序进行组间差异，P<0.05为有统计学意义。
3 结果
3.1 各组血清HA Col-Ⅳ检测结果比较
与A组比较，B组大鼠HA、Col-Ⅳ血清含量均明显升高(P<0.01)；与B组比较，C组、D组大鼠的HA与Col-Ⅳ的血清含量均显著降低(P<0.01)；在降低HA方面。D组与C组无显著差异；而在降低Col-Ⅳ方面，D组的疗效明显优于C组(P<0.05)。见表1。
3.2 肝组织胶原染色(Masson)病理形态学观察
A组大鼠肝实质内未见明显的阳性着色区；B组汇管区可见大量纤维结缔组织增生 ......
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