补虚化瘀针法对骨质疏松大鼠I型胶原mRNA表达的影响(1)
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摘要：目的：探讨“补虚化瘀”针法对骨质疏松大鼠I型胶原基因表达的影响。方法：选择8月龄wistar雌性大鼠50只，随机抽取10只作为空白对照组即假手术组，其它40只做去势手术。3个月后将去势大鼠随机分成模型组、针刺组、针刺加雌激素组、雌激素组。共治疗12周。治疗结束后，取大鼠股骨做I型胶原mRNA原位杂交检测。结果：实验表明，治疗组与模型组相比，I型胶原mRNA在成骨细胞内表达明显，且细胞数目增多。经图像分析系统测定，阳性反映面积与灰度测值均有明显差异(P<0.01)。结论：“补虚化瘀”针法对骨质疏松大鼠有治疗作用，可增强I型胶原mRNA表达的活性。
关键词：骨质疏松；补虚化瘀针法；1型胶原mRNA
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2009)05-1034-03
骨质疏松症(Osteopomsis)是以骨组织显微结构受损，骨矿成分和骨基质等比例减少，骨折危险度升高为特征的一种全身骨代谢障碍性疾病。祖国医学称之为“骨痿”、“骨枯”、“骨痹”。现代医学认为I型胶原基因是调节骨量的强有力的候选基因。导师王富春教授结合多年临床经验，始创“补虚化瘀”针法治疗本病，取得良好疗效。本研究主要是立足于研究“补虚化瘀”针法对骨质疏松大鼠I型胶原基因表达的影响，探讨针灸治疗本病的微观作用机理。为针灸临床治疗奠定良好的实验基础。
1 实验材料与方法
1.1 实验动物分组与造模
1.1.1 分组 Wistar大鼠50只，8月龄，体重在300～350g，雌性，[许可证号：SCXK-(吉)2003-0004]。常规喂养1周后，按体重随机分成5组。有4组做去势手术，1组做假手术。在去势手术完成第3个月后，对40只去势大鼠按体重随机分为4组与假手术组一共分成：假手术组、模型组、针刺组、针刺加雌激素组、雌激素组。
1.1.2 造模 备皮、消毒、在下腹正中沿腹中线做2cm左右切口，剪开肌层，找到子宫，沿子宫找到粉红色卵巢，节扎切除。假手术组在找到卵巢后，将其周围的脂肪剪去一部分，保留卵巢。皮肤缝合。局部涂撒青霉素粉，预防感染。共做去卵巢40只，假手术处理10只。术后禁食12h，分10笼饲养。每天腹腔注青霉素0.2～0.3mL/只，连续注射8天。3个月造模成功后开始治疗。
1.2 治疗方法
1.2.1 电针治疗 对针刺组和针刺加雌激素组进行电针治疗。方法如下：选穴：按“补虚化瘀”针法进行针刺，选取大椎、大杼(双)、脾俞(双)、肾俞(双)、命门、足三里(双)、绝骨(双)。每穴直刺0.1～0.2寸，施捻转补法进针，得气后在肾俞和脾俞、足三里和绝骨加电针，以针柄微颤为度，连续频率在2档，输出量在1档与1.5档间。每次持续20min。10天1个疗程，疗程间休息4天。共治疗了6个疗程。
1.2.2 雌激素治疗 对针加雌激素组、雌激素组给予雌激素治疗方法如下：按实验室药物人鼠比例换算，肌肉注射苯甲酸雌二醇，0.3mg/kg(70kg人用量的21倍)，每周2次，共治疗12周。
1.3 I型胶原mRNA愿位杂交的检测
1.3.1 主要实验器材及药品 Collagen I大鼠mRNA原位杂交DIG染色系统：天津市灏洋生物制品科技有限责任公司提供(批号：060117)。两端标记寡核苷酸Collagen I探针(2005CO 2mL)、寡核苷酸探针预杂交液(FISH002mL)、复合消化液(WE)pH：6.4(TSP6044 6mL)、生物素标记的小鼠抗地高辛(DB7405B 6mL)、高敏过氧化物酶链亲和复合物(AA7419H 6mL)、DAB Kit(I)5637 3mL)。
Collagen Type I探针大鼠用序列：5’-TGATG CCAACGTGGT TCGTC ACCGT GACCT-3’探针浓度为8μg/mL。由天津市灏洋生物制品科技有限责任公司提供。
1.3.2 实验方法 (1)骨组织切片的制备：固定：将大鼠右侧股骨放入10%福尔马林缓冲液甲醛溶液固定3天。脱钙：将骨组织放入10%EDTA溶液(含0.1%DEPC水)中脱钙45天。脱水：组织纵断取材后，经梯度酒精(80%乙醇24h，95%乙醇12h反复2次，100%乙醇1h反复2次)脱水，二甲苯透明浸泡30min，反复2次。包埋：组织取出后浸入石蜡中30min，更换石蜡反复浸泡3次，石蜡凝固后取出蜡块。切片：用切片机切片，厚度为5μm，置于蒸馏水中，载玻片捞起后在60℃恒温箱中过夜，石蜡切片制备完毕待用。
(2)原位杂交试验：①将准备好的石蜡切片脱腊至水：冲洗二甲苯2次，10min/次；无水乙醇10min 1次；90%乙醇10min1次；80%乙醇10min1次；0.1M PBS冲洗3次。②置打孔液中室温10min，给细胞打孔以改变组织细胞的通透性使探针快速顺利的穿透细胞膜。0.1 M PBS冲洗3次。③置过氧化氢封闭液室温20min，以封闭内源性过氧化氢酶。0.1M PBS冲洗3次。④滴加复合消化工作液，覆盖组织表面，室温10min。0.1M PBS冲洗3次。0.2 Xssc缓冲液洗1次(室温3min)。滴加预杂交工作液覆盖组织37℃湿盒孵育4h，盖上原位杂交专用盖玻片。⑤预杂交后的洗涤一揭去盖玻片以0.2 Xssc室温洗3次，每次洗5min。滴加杂交工作液(含寡核苷酸探针)覆盖组织37℃湿盒孵育过夜。⑥杂交后的洗涤——揭去盖玻片以2 Xssc 37℃洗3次，每次洗5min，0.2 Xssc 37℃洗3次，每次洗5min，0.1mo1TBS 37℃洗5次，每次洗5min。⑦滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，覆盖组织4℃湿盒孵育过夜 ......
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