猫爪草皂苷对结肠癌LoVo细胞凋亡和线粒体电位的影响
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摘要：目的：探讨猫爪草皂苷(Radix rannculus temate saponins，RRTS)对人结肠癌LoVo细胞的增殖和凋亡作用及作用机制。方法：按猫爪草皂苷浓度分为1、10、100、500μg·mL-14个处理组和对照组(未加猫爪草皂苷)，处理LoVo细胞不同时间后，倒置显微镜观察细胞形态；采用MTT法检测细胞增殖的抑制情况；流式细胞仪(FCM)分析细胞周期和凋亡率。结果：与对照组比较，猫爪草皂苷处理组可使细胞明显变圆、体积缩小、脱壁细胞增多；MTT法检测显示，猫爪草皂苷处理组随着浓度的增加和作用时间延长，对LoVo细胞的增殖抑制作用增强，并呈时间、剂量依赖性(P<0.001)；随着浓度的增加凋亡率增加，药物组与对照组比较差异有显著性(P<0.001)；流式细胞仪细胞周期分析图可看出细胞阻滞在G1期，随着给药浓度的增加，细胞凋亡峰(AP峰)越来越明显(图1)；激光共聚焦扫描技术观察显示，细胞经皂苷作用4h、8h、12h后，线粒体膜电位下降(P<0.05)。结论：猫爪草皂苷可导致人结肠癌LoVo细胞线粒体膜电位下降，具有明显抑制增殖和诱导凋亡作用。
关键词：猫爪草皂苷；结肠癌LoVo细胞；细胞增殖；细胞凋亡；线粒体膜电位
中图分类号：11737.25 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2009)05-1079-03
猫爪草系毛茛科植物小毛茛(Ranunculus tematusThunb)的块根，性平，味甘、辛，归肝、肺经。有解毒、化痰散结之功能，临床上用于治疗肺结核、颈淋巴结核、咽喉炎、淋巴癌、甲状腺肿瘤及乳腺肿瘤等疾病。王爱武博士发现猫爪草皂苷对肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌MCF27细胞的生长和集落形成均有不同程度的影响，皂苷给药量与抑瘤率和集落形成明显地呈正相关。早期研究报道，猫爪草Cu/Zn值趋向与癌症患者Cu/Zn值相反，猫爪草有效成分对肿瘤坏死因子有诱生作用。基于此，本研究观察猫爪草皂苷对结肠癌LoVo细胞体外增殖和凋亡的影响，并进一步探讨作用机制。
1 材料
1.1 细胞 人结肠癌细胞株LoVo购于中南大学湘雅中心实验室。
1.2 药物和主要试剂 猫爪草皂苷为河南中医学院第一附属医院中心实验室提供；罗丹明123(Rhodaminel23)荧光探针，Sigma公司。
1.3 主要仪器 倒置显微镜，日本Olympus公司；全自动酶标仪，奥地利；流式细胞仪，Coulter，USA；激光共聚焦系统，德国Lcica公司。
2 方法
2.1 猫爪草皂苷作用的观察①细胞毒性测定(MTT法)用含10%胎牛血清的RPM11640液调细胞浓度为1×104/孔，接种于96孔板，过夜培养，次日实验组加入不同浓度的皂苷，其终浓度分别为1、10、100和500μg·L-1，对照组只加等量的PBS液，每组设6平行孔，将培养板置于5%CO2、37℃培养箱中，继续培养24、48和72h，在额定时间将每孔加入MTF20p,L，继续培养4h，吸去上清液，加入DMSO(150μL/孔)，混匀10rain后，在酶标仪上测定各孔490nm处的吸光度A值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。②流式细胞仪(FCM)测定细胞周期和凋亡率不同浓度皂苷处理LoVo细胞，同时设阴性对照组，于24h后PBS洗涤后收集细胞，加入预冷的乙醇(浓度为70%)，于4℃固定24h，离心洗涤后，悬浮于PI染液中，最后以300目筛网过滤，调整细胞浓度为1×106·mL-1，流式细胞仪分析，激发光源为氩离子激光，激发波长488nm，用Mulficycle DNA分析软件行细胞周期的测定。
2.2 激光共聚焦扫描技术观察线粒体膜电位的变化细胞的处理：取对数生长期LoVo细胞，经消化、吹散、重悬于10%小牛血清RPMll640培养液中，调整细胞浓度为5×104%dl·L-1。加入内置盖玻片(多聚赖氨酸浸泡，晾干)的6孔培养板内2.5mL，培养24h后分别在不同时段加入含皂苷(100μg·L-1)小牛血清10%的RPM11640培养液中，于4h、8h、12h等时相点终止培养进行观察，另设不加入皂苷的为对照。罗丹明荧光探针标记：皂苷对细胞作用不同时间后，Rh0123 10μg·mL-1染色，在37℃，5%CO2培养箱温育15min，PBS洗3次。用激光共聚焦观察线粒体膜电位的变化：每组选择不同视野的单个细胞，用激光共聚焦显微镜的图像分析系统(TCS～Tool)分析整个胞内的荧光强度(膜电位变化以荧光强度表示)，统计不同作用时间细胞的荧光值，计算的变化。
2.3 统计学方法 用SPSS 10.0统计软件包，进行，检验。
3 结果
3.1 细胞形态学观察结果 倒置显微镜下观察，经皂苷处理12和24h后，部分细胞贴壁脱落，悬浮于培养液中，细胞变圆，体积减小，核固缩，核颜色加深，折光性增强，其中500μg·mL-1皂苷作用24h最明显，细胞数少，脱壁细胞明显增多。对照组细胞贴壁生长，细胞呈多角形，胞质饱满，生长舒展，相邻细胞生长融合成片。
3.2 猫爪草皂苷对LoVo细胞的抑制作用
不同浓度皂苷作用24、48、72h后，LoVo细胞的生长均不同程度地受到抑制，并呈浓度和时间依赖性特点，其中以500μg·mL-1皂苷在72h时抑制率为最高。皂苷处理组LoVo细胞生长抑制率与对照组比较，差异均有显著性(P<0.001)，见表1。
3.3 流武细胞仪定量分析 与对照组相比，24h后各组随着药物浓度的增加，G1期细胞数量增多，S期、G2期细胞下降，见表2。凋亡率分别为7.1%、13.7%、18.0%和27.4%，差异显著(P<0.001)。细胞凋亡峰越来越明显(图1)。
3.4 激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位的变化100μg·mL-1皂苷作用4h细胞荧光含量(134.55±7.68)显著减弱，8h为(111.16±9.30)，12h后细胞的线粒体膜电位强度进一步下降(92.97±11.44)。各组与对照组(215.26±12.58)差异显著(P<0.05)。
4 讨论
肿瘤细胞无限增殖是肿瘤发生发展的主要原因。如长春花碱、紫杉醇、三尖杉碱、喜树碱等常用抗肿瘤药物，作用于肿瘤细胞生长的不同阶段，使细胞生长所需要的DNA、RNA、蛋白质合成受到严重阻碍，从而使肿瘤细胞停止于增殖周期的某一时相，或作用于肿瘤细胞能量代谢的某一环节，导致肿瘤细胞呼吸链受阻死亡，或破坏细胞膜引起细胞自溶死亡。本观察显示 ......
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