(2)制备血清[3]:第5天末次灌胃给药1h后于大鼠颈动脉插管无菌取血,置无菌不抗凝管中,室温下静置3～4h,1500r/min离心20min,吸上清液,无菌分离血清,同组血清混合,置于无菌试管中,分别制备成YTⅡ血清、YTⅠ血清和KX血清,分装后置-20℃冰箱中冻存,经培养实验证明无微生物污染后使用。临用时将含药血清溶化,56℃水浴灭活30 min,0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

    1.2.2 鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)造模 (1)种蛋孵育:将45个种蛋参考相关文献[4]进行孵育。孵育第3天在照蛋灯下,观察种蛋生长情况,剔除未受精卵、未发育或死胚及卵黄破裂胚。

    (2)建立CAM模型:参照贺国安等[5]的“无气室孵育法”加以改进,取6日龄鸡胚在无菌操作且保持一定温度下建立CAM模型;在CAM上方位置开窗,剪除窗口内的卵壳膜及气室膜,暴露鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)。

    1.2.3 分组实验操作 将开窗成功的鸡胚40个随机分为KX组、YTⅠ组、bFGF组、YTⅡ组4组,每组10个种蛋。其中, KX组为阴性对照组,bFGF组、YTⅠ组为阳性药物对照组。将直径约为0.4 cm的混合纤维素酯微孔滤膜片(已高压灭菌)作为载体置于各组CAM正对观察窗的表面无血管或血管最少处,然后用移液器分别吸取KX组、YTⅠ组、YTⅡ组血清和bFGF组各10μL,滴加于载体上。各组种蛋均用无菌透明胶封窗,标记后继续孵育72h,孵育时窗口朝上,不再翻蛋,每天开箱透气2次,随时剔去死亡鸡胚。同时,每隔24h各药物组和KX组各滴加1次10μL检测物于载体上,72h后不再滴加;无菌操作,保持鸡胚在一定温度下操作 ......