银杏叶提取物对同型半胱氨酸诱导HUVECs凋亡中JNK表达的影响(2)
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1.3Tunel细胞凋亡检测按试剂盒说明进行
苏木素复染后封片,在光镜下分析结果。细胞核内见到棕褐色颗粒为凋亡阳性细胞。在显微镜下每组随机取3～5个不同视野,计算各个视野细胞凋亡指数(apoptosis index)=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%,再取其均数作为该组细胞凋亡指数。
1.4Western Blot检测不同浓度Hcy刺激下P-JNK时间动态变化
实验组测定2个浓度Hcy(0.1、10.0 mmol/L)刺激下,P-JNK随时间的动态变化,观察其趋势是否相同。实验过程如下:同步化和洗涤后的细胞,加入0.1 mmol/L或者10.0 mmol/LHcy刺激,分别在刺激后0、15、30、1、2、4、8h,取出6孔板,提取细胞总蛋白,用BCA法测定总蛋白浓度,将每组总蛋白浓度稀释成1.0mg/mL,每组加入2×SDS上样缓冲液混合,沸水浴中加热5min变性,冰上骤冷,样品于聚丙烯酞胺凝胶电泳分离蛋白,然后电转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭1h,孵育塑料小盒中加入5%牛血清白蛋白稀释的兔抗人P-JNK多克隆抗体(1∶1000)或兔抗人JNK多克隆抗体(1∶1000),4℃过夜,5%牛血清白蛋白稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1∶1000),室温2h,膜于增强发光检测试剂(试剂A:试剂B=1∶1)反应5min,取出膜,甩去多余的检测试剂,保鲜膜包好NC膜,曝光,显影,定影。LISCAP CAPTURE凝胶照相分析软件分析P-JNK及JNK光密度值,两者均以对照组样品的光密度值为参照(定为1),以此来标准化其他条带的光密度值,再以JNK1/2光密度值来标准化P-JNK1/2光密度值,即以P-JNK光密度值/JNK光密度值的比值代表样品P-JNK的光密度。
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1.5Western Blot检测不同浓度Hcy刺激下P-JNK的表达
实验组测定5组不同浓度Hcy(0.1、0.3、1.0、3.0、10.0mmol/L),不同浓度EGb(12.5μg/mL、25.0μg/mL)预处理后Hcy刺激下,P-JNK水平的变化,同步化和洗涤后的细胞,在上述浓度的Hcy刺激2h后[5],取出6孔板,提取细胞总蛋白,用于Western Blot检测P-JNK水平,每组设3孔。
1.6统计学处理
全部数据经SPSS 11. 0统计软件进行分析,数据以均数±标准差(±s)表示,多组比较采用单因素方差分析,两两比较方差齐者用LSD检验,方差不齐者用Dunnett’T3检验。
2 结 果
2.1TUNEL方法检测不同浓度Hcy及EGB对HUVECs凋亡的影响 TUNEL阳性细胞表现为细胞核内见到棕褐色颗粒,结果显示细胞凋亡指数随着Hcy浓度增加而升高,0.3mmol/L Hcy即可以引起凋亡指数明显升高,与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。其中以 10.0mmol/L Hcy时凋亡指数最高,达(40.21±1.30)%。EGb1组和EGb2组在加Hcy之前先用EGb预处理1h后,再加入同样Hcy浓度(10.0mmol/L)继续培养24h,发现加入12.5μg/mL EGb能使HUVECs凋亡指数减少,25.0μg/mL浓度EGb对Hcy诱导的HUVECs凋亡拮抗作用更加明显,与Hcy10.0mmol/L组比较差异有统计学意义(P<0.01),并且两种加有不同浓度EGb的组别之间也有显著性差异(P<0.01),说明EGb对Hcy诱导的HUVECs凋亡有明显的抑制作用。见表1。
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2.2Western Blot检测各实验组JNK磷酸化变化比较
2.2.1 Hcy刺激下JNK1/2随时间的动态变化
两种浓度Hcy刺激下,P-JNK1/2随时间的动态变化趋势较为相似:各实验组的P-JNK1/2水平均高于对照组(Con组,看成零时刻),差异有统计学意义(P<0.01),0.1mmol/L刺激时,15min明显磷酸化,持续至4h,高峰发生在2h,(2.96±0.16)倍于对照组水平,8h回到接近于对照组水平;10.0mmol/L刺激时,15min明显磷酸化,持续至8h,高峰发生在2～4h,(6.56±0.35)倍于对照组水平,差异有统计学意义(P<0.01),2h与4h之间无显著性差异(P>0.05);浓度越高P-JNK1/2水平持续越久;两者均在30min出现了短暂的下降期,见图1。
2.2.2 不同浓度Hcy刺激下P-JNK的动态变化研究结果显示:各浓度实验组(分别0.1、0.3、1.0、3.0、10.0mmol/LHcy)刺激P-JNK1/2均高于对照组,差异有显著性(P<0.01),并且JNK1/2磷酸化与Hcy呈明显的剂量依赖关系,浓度越高,P-JNK1/2水平越高,最高的发生在10.0mmol/L组,约6倍于对照组水平,差异有统计学意义(P<0.01),而且相比其他4组,JNK1/2磷酸化水平均明显低于10.0mmol/L组,差异也有统计学意义(P<0.01),见图2。
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2.2.3不同浓度EGb对10.0mmol/LHcy刺激下的JNK磷酸化水平的影响 研究显示:10.0mmol/LHcy刺激下P-JNK较对照组(Con组)明显升高(P<0.01);EGb(12.5μg/mL、25.0μg/mL)均可抑制10.0mmol/LHcy诱导的HUVECs的JNK磷酸化,有统计学意义(P<0.01),而且25.0μg/mL组抑制作用明显优于12.5μg/mL组,差异有统计学意义(P<0.01),EGb浓度越高抑制越明显,见图3。
3 讨 论
Hcy是近几年来倍受关注的可能是动脉粥样硬化独立危险因素之一,它可以通过损伤内皮细胞引起细胞凋亡、促进炎症介质释放和平滑肌细胞增殖、破坏凝血功能平衡等多方面引起动脉粥样硬化的发生和发展[6]。而内皮细胞异常与动脉粥样硬化关系密切,Harker等认为内皮细胞结构和功能上的损伤能启动动脉粥样硬化发生,并促进其发展。而EGb脑保护作用的机制目前明确的有两个方面: 一方面通过拮抗血小板活化因子( PAF) ,减轻脑缺血时PAF所造成的损伤;另一方面能清除体内自由基,产生抗氧化作用,减轻脑缺血时体内产生的过多自由基对脑组织造成的损伤[7]。EGb是否对Hcy诱导HUVECs凋亡有保护作用目前报道不多。
本实验采用TUNEL方法检测Hcy对HUVECs的毒性作用,结果显示低浓度的Hcy即可导致细胞凋亡,但是细胞凋亡率提高不明显,与对照组相比差异没有显著性,但是随着Hcy浓度增加,细胞凋亡率明显升高,本实验进一步证实细胞凋亡可能是Hcy对HUVECs的毒性作用机制之一。实验结果还显示Hcy对HUVECs的毒性作用可能是浓度依赖关系。而先给予EGb预处理后,再加入高浓度的 Hcy继续培养发现细胞凋亡有所减少,而且以高浓度EGb时减少细胞凋亡为甚,说明EGb可能抑制Hcy诱导的HUVECs凋亡作用。由于细胞坏死后可以出现少量3-OH末端,因此坏死细胞也可能出现阳性反应,使细胞凋亡比率高于实际水平,这些有待以后实验中进一步完善。, 百拇医药(叶小军 冯 燕 王小同 何志勇 黄汉津)