中药上消合剂对大鼠急性放射性食管损伤上皮细胞凋亡影响的实验研究(2)
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1.3 实验试剂
大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒为武汉博士德公司生产,批号为:EK0526;Bcl-2免疫组化检测试剂盒[Bcl-2(N-19) SC-492]为美国santa cruz公司生产,批号为:EO307;Bax免疫组化检测试剂盒[Bax (P-19) SC-526]为美国santa cruz公司生产,批号为:E1607;TUNEL试剂盒为德国Roche公司生产,批号为:11684817910。
1.4 治疗方法
空白组动物常规饲养,不进行造模及药物干预。造模组动物造模后不进行药物干预;生理盐水组动物每日管饲与中药组同等容积的生理盐水(旨在了解灌胃对食管黏膜的损伤情况);氨磷汀组大鼠于照射前30min腹腔内注射稀释后的氨磷汀150mg•kg-1,造模后不予药物干预;中药组大鼠造模当天开始每日管饲上消合剂10mL•kg-1•d-1。后禁食禁水30min,连续用药14天。分别于照射后第7天及第14天每组各处死10只大鼠进行实验观察。
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1.5 食管取材
将随机抽取所得大鼠用腹腔注射2%戊巴比妥钠0.12mL/100g麻醉,后取4mL腹主动脉血于试管中用于检测TNF-α;处死后取大鼠上段食管(双耳下缘连线上0.5cm开始往下4cm范围)组织固定于10%缓冲性福尔马林液中,用常规法制成石蜡切片备用。
1.6观察指标
1.6.1 TNF-α的检测大鼠腹腔动脉取血,1500r/min离心,取上清液。ELISA法检测血清中TNF-α的含量。
1.6.2 大鼠食管上皮细胞凋亡指数的测定用TUNEL法染色组织切片。光镜下细胞核呈黄色或棕色阳性颗粒者为凋亡细胞,衬染细胞核呈蓝色。每次都设立阴性对照。阳性对照用DNA酶处理切片10min。凋亡指数用%表示。每张切片在200倍视野下计数200个以上上皮细胞中染色阳性的细胞数(阳性细胞不包括炎症细胞),换算成凋亡指数,凋亡指数=视野内的阳性细胞数/视野内总细胞数×100%。每只大鼠观察3张切片,每张片子测量后取其平均值。
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1.6.3 Bcl-2及Bax蛋白表达平均光密度值(OD)的测定 用免疫组化法染色组织切片。光镜下,各组Bcl-2及Bax的阳性染色呈棕黄色或棕褐色,细胞核衬染呈蓝色。阳性区域主要定位于食管的鳞状上皮细胞,浸润的炎症细胞和部分的间质细胞的胞浆内,胞膜偶见。每张切片随机采集5个鳞状上皮细胞视野(×200倍),经过Image-ProPlus 5.0图像分析软件系统自动分析获得该5个视野的5个光密度值,经平均后代表该切片的染色强度,即OD值。每只大鼠观察3张切片,取其平均值代表该样本的测量值。
1.7 统计方法
使用SPSS 11.5统计软件包进行统计分析处理。数据用均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用One-way ANOVA分析,两两比较采用LSD检验。均以P<0.05具为统计学差异,以P<0.01为显著统计学差异。
2结 果
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2.1 各组食管上皮形态学及凋亡指数比较
食管组织原位末端标记染色显示凋亡细胞核呈棕褐色,空白组凋亡细胞较少,均匀分布于食管复层鳞状上皮的各层细胞。造模组的凋亡细胞主要为食管复层鳞状上皮的近基底层细胞,以基底层细胞为主,越近管腔层凋亡细胞越少,另外成纤维细胞、血管内皮细胞和炎细胞也可见凋亡细胞。造模组第7天时及第14天时均分别较空白组显著增多 (P<0.01),生理盐水组与造模组比较无统计学差异(P>0.05)。氨磷汀组及中药组的AI值无论第7天还是第14天均明显降低(与造模组比较P<0.01),而两组之间比较无统计学差异(P>0.05),AI值见表1。
2.2 各组凋亡相关基因 Bcl-2及Bax蛋白表达的比较
Bcl-2及Bax蛋白表达以胞浆染色呈棕黄色为阳性。空白组中, Bcl-2及Bax蛋白主要表达于食管上皮层,Bcl-2 OD值最高,Bax OD值最低, Bcl-2/Bax值超过1.5。造模组的Bcl-2及Bax蛋白表达也主要分布于食管上皮层,Bcl-2 OD值在放疗后无论是第7天还是第14天均明显低于空白组(P<0.01);Bax OD值无论第7天还是第14天均高于空白组(P<0.05),Bcl-2/Bax值亦显著降低(与空白组比较P<0.01)。生理盐水组Bcl-2及Bax蛋白表达情况与造模组相仿。氨磷汀组与中药组Bcl-2 OD值无论在放疗后第7天还是第14天较造模组增高 (P<0.05);氨磷汀组第14天时的Bax OD值较造模组略低(P<0.05),而中药组的Bax OD值与造模组无统计学差异(P>0.05)。氨磷汀组无论第7天还是第14天的Bcl-2/Bax值较造模组显著增高(P<0.01),中药组第7天时的Bcl-2/Bax值与造模组相仿,第14天的Bcl-2/Bax值较造模组明显增高(P<0.01),见表1。
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2.3 各组外周血TNF-α的浓度比较
各处理组受照后血清TNF-α的浓度均高于空白组(P<0.05);生理盐水组和造模组相仿,无统计学差异(P>0.05)。在照射后第7天中药组血清TNF-α的浓度低于造模组(P<0.05);照射后第14天中药组血清TNF-α的浓度进一步降低(与造模组比较P<0.05)。氨磷汀组血清TNF-α的浓度第7天时与造模组比较无统计学差异(P>0.05),第14天时比造模组低(P<0.05),见表1。
4讨 论
从中医的角度来看,放射性食管炎是由于人体接受辐射射线的照射后,外感“火热邪毒”,邪气入于气分、营分、血分,热毒炽盛,蕴结于咽喉、食管所致,与“噎膈”的气结、火郁、痰凝、血瘀、津枯的病机相符。火邪通过焚灼阴液(生命液体物质)、人体固有物质(食管黏膜)引起食管组织变性坏死并导致食管炎的发生。即火毒之邪侵犯脏腑,胃失和降,津伤血燥,耗气伤阴,气阴不足,阴虚内热,以至食道干涩,食物难入。同时因暴受外邪,痰湿内阻,水谷不化,脾胃运化功能失调,以致痰饮上逆。其中既有邪实的一面,即气结、痰凝、血瘀,又有本虚的一面,即津枯血燥,病理性质为本虚标实,又相互影响。疾病初起时为实证,日久气阴不足,劳倦内伤,虚实夹杂。主要病位在食管,与胃、肝、脾关系密切。故治疗原则为清热解毒,益气养阴,疏肝和胃,配以活血行气、消肿生肌。目前治疗放射性食管炎以临床研究为主,如使用经典方剂桔梗汤[2]、沙参麦冬汤加减[3]等,以及较多自拟方,如“银翘青黛汤[4]”、“双地合剂[5]”等。从临床疗效看,中药能改善急性放射性食管炎临床症状,近期疗效肯定,尤其是缓解吞咽疼痛效果可达97.1%[4]。
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从西医的角度分析辐射诱导的细胞损害通常根据细胞形态学上的特征性改变分为细胞坏死和细胞凋亡两种,辐射作为基因毒素造成细胞死亡的主要机制是细胞调亡。国内沈莉等[6]观察到照射大鼠食管上段43Gy后第7天及第14天食管上皮细胞坏死剧烈,出现严重的放射性损伤。Epperly等[7]报道对C3H/HeNsd小鼠食管一次性大剂量照射35Gy后第4天即观察到食管上皮细胞凋亡,与空白组比较凋亡明显增加,其凋亡指数分别为51.5% vs0%。放射性食管损伤是由于放射线使食管组织中的水分子大量分解成自由基所引起的,体内过多的氧自由基,在攻击细胞器导致细胞坏死的同时,促进大量的炎性因子(IL-1,1L-6,TNF-α等)的产生,这些细胞因子成为促进细胞凋亡的诱导因素[8],通过一定的信号传递方式激活生存与死亡的相关基因,包括P53、Bcl-2家族、Fas/apo-1/CD95、Caspase蛋白酶家族等。研究表明Bcl-2和Bax基因是主要的调控基因之一,Bcl-2抑制细胞凋亡,Bax促发细胞凋亡,所以Bcl-2/Bax比值决定细胞命运,Bcl-2/Bax比值下降会促进细胞调亡,反之亦然[9-10]。文献报道[11]由辐射导致的视网膜色素上皮细胞凋亡率与抗凋亡基因Bcl-2的表达呈负相关,而与Bax的表达呈正相关有关。在急性放射性皮肤溃疡的动物模型中观察到照射后14~21天为Bax蛋白表达高峰,Bcl-2蛋白则在11天后逐渐降低,至14~40天呈阴性,所以皮肤上皮细胞的凋亡高峰出现在照射后11～35天[10,12]。但是射线致食管上皮细胞凋亡的调控机制尚不清楚。, http://www.100md.com(周 霞 张 谷 赖宵晶 王跃珍 郑 晓 马胜林)