蜕皮甾酮对氧化损伤的人晶状体上皮细胞凋亡的防护作用(2)
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本研究拟在复制人晶状体实验性氧化损伤模型的基础上,以E2为阳性对照,探讨中药植物雌激素ECR对氧化损伤的HLEC-B3的防治作用,为寻求防治白内障的确切有效的药物提供科学的实验依据。
1材料与方法
1.1主要仪器
流式细胞仪(美国B-D FACScan)、电子显微镜(日立H-7650),超薄切片机(LaiCaUC-6) 、二氧化碳培养箱(美国FORMA 2111)、倒置相差显微镜(日本Olympus IMT-413)、超净工作台(江苏SW-CJ-IF)、微量移液器(法国GILSON)、冰箱(青岛BCD-268)、超低温冰箱(日本MDF-V5410)、微量电子天平(上海FA200X)、低速水平离心机(北京LD4-2)、恒温水浴锅(深圳HH-4)、干燥箱(上海101A-2)等。
1.2主要试剂
HLE-B3系中山大学惠赠的永生化人晶状体上皮细胞B3系,经复苏、传代培养所得。雌二醇粉末,纯度97%,美国Sigma公司产品;蜕皮甾酮(Ecdysterone, ECR)粉末,纯度96.3%,购自中国药品生物制品检定所;胰蛋白酶为美国GIBCO公司产品,乙二胺四乙酸为美国Augus公司产品;DMEM培养基干粉为美国GIBCO公司产品,新生小牛血清为奥地利PAA公司产品,核糖核酸酶A、碘化丙啶和线粒体跨膜电位试剂Rhodamine123系美国Sigma公司产品。
1.3 HLE-B3复苏 培养及传代
取出保存于液氮罐中的冻存细胞的冻存管立即放入37℃水中,将溶解的细胞悬液用10倍体积以上的培养液进行稀释,离心,除上清,反复洗涤3次。以5×105个/mL接种于培养瓶中,37℃、5%CO2培养箱培养。待细胞生长融合后进行传代培养,弃去培养液,PBS液洗1次后,加入预暖的消化液1～2mL(含0.01% EDTA+0.25%胰蛋白酶),5～8min后倒置显微镜下观察,见细胞收缩、变圆后,立即加入含NCS的DMEM终止消化,用吸管轻轻吹打,使贴壁细胞脱落,制成细胞悬液。将细胞悬液离心(1500r/min,5min),去消化液,PBS洗1次,离心去上清,按1∶2分瓶传代。置于37℃、5% CO2培养箱中,2～3天细胞融合后继续传代培养。
1.4 分组与给药
对照组:HLE-B3+含10%NCS的DMEM培养液;H2O2组:对照组+3×10-4mol/LH2O2;E2组:H2O2组+10-8mol/L E2;ECR组:H2O2组+ 10-7mol/LECR
1.5透射电子显微镜观察HLE-B3超微结构的变化
按上述分组将H2O2以及E2、ECR分别与HLE-B3共同孵育24h后,收集细胞;将消化离心后的细胞以3%戊二醛-1.5%多聚甲醛混合液固定,4℃过夜,1%锇酸后固定,醋酸铀快染,乙醇-丙酮脱水,环氧树脂618包埋,超薄切片,醋酸铀和柠檬酸铅双重染色;于透射电子显微镜75kv条件下观察HLE-B3超微结构变化,并摄影记录发生细胞凋亡的情况。
1.6 FCM法检测E2和ECR的凋亡率
按上述分组将H2O2以及E2和ECR分别与HLE-B3共同孵育24h后,收集细胞;用PBS清洗离心两次,将预冷的70%乙醇沿壁缘滴入,轻轻吹打细胞,4℃固定12 h以上;离心(1500 r/min,5 min),去固定液,PBS清洗两次,弃上清;加入浓度为1mg/mL RNase A 30μL,37℃恒温水浴锅中孵育30 min;加入PI染色液800μL,4℃ 避光30 min;上机检测HLE-B3 的凋亡率,每次计数10000个细胞,所有资料经Modfit V3.0软件分析。
1.7 用FCM 检测细胞内线粒体跨膜电位(mitochondria trans-membrane potential,ΔΨM)的变化
按上述分组将H2O2以及E2和ECR分别与HLE-B3共同孵育24h后,收集细胞;用PBS清洗离心两次,弃去上清;加入Rhodamine123染液,终浓度为25μM,摇匀离心细胞,于37℃恒温水浴锅孵育30min;离心(1500r/min,5min),去上清,用PBS重悬细胞;上机检测,激发波长488nm,发射波长525nm,通过cellquest软件分析平均荧光信号强度,计算ΔΨM平均荧光强度值(mean intensity of fluorescence,MIF) ......
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