温下方抑制肺癌A549细胞增殖及对PCNARbCyclinD1表达的影响(2)
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参见附件。
2.4 激光共聚焦显微镜法测PCNA Rb cyclinD1蛋白表达 采用免疫荧光细胞化学法。PCNA、Rb、cyclinD1抗体的效价均为1∶100。标本PBS洗3次,山羊血清室温孵育15min,分别加入一抗,4℃过夜;PBS洗3次,加入荧光素标记的二抗,室温孵育20min;PBS洗3次。激光共聚焦显微镜进行分析[2],表达强度用平均荧光强度表示。
2.5 数据分析采用SPSS 11.5软件包进行统计分析,数据用均数±标准差(±s)表示,计量资料用配对t检验,计数资料用χ2检验。
3 结 果
3.1 含药血清对肺癌A549细胞生长的抑制作用
表1含药血清对肺癌细胞生长的抑制作用 (%,±s)
注:与对照组比较, *P<0.05,** P<0.01。
实验结果显示:含药血清作用12h,含药血清组与对照组比较,对肺癌细胞的抑制率有增加均势,统计学无显著性差异;作用24 h后,含药血清组与对照组比较,对肺癌细胞的抑制率显著增加,统计学有显著性差异(P<0.05);作用36 h后,含药血清组与对照组比较,对肺癌细胞的抑制率显著增加,统计学有显著性差异(P<0.01)。
3.2 温下方对肺癌PCNA、Rb、CyclinD1表达的影响 见表2,图1～12。
实验结果表明,含药血清组与对照组比较,PCNA、CyclinD1表达明显降低,平均荧光强度明显降低,统计学有显著性差异(P<0.05)。
表2含药血清对PCNA Rb CyclinD1表达的影响(±s)
4讨 论
温下方由附子、大黄、人参、当归4药组成。附子补火助阳,大黄泻下荡实,人参大补元气,补脾益肺。当归功能补血活血,4药合用,寒温同用,辛苦并行,攻补兼施,温、补、下、消4法同施,相反相成,共成温通寒积之剂,使寒邪祛,阳气复,积滞下,瘀血通,针对阳虚阴盛、邪毒内结之肺癌,恰对病机。
笔者的研究以血清药理学实验方法为平台,MTT方法检测温下方含药血清对肺癌细胞的生长抑制作用,实验结果表明,A549细胞经温下方含药血清大、小剂量组孵育24h、36h后,对细胞生长有明显抑制作用,最高抑制率可达42.02%。
PCNA的合成与DNA复制和细胞增殖更接相关。是控制DNA复制以及细胞分裂的关键因素,因此它的表达程度反映了细胞增殖活性的高低,目前已把它作为衡量细胞增殖状态的一个客观指标[3]。笔者的实验结果表明温下方含药血清作用后,PCNA表达降低,说明温下方能够降低A549细胞的增殖活性。
研究表明,肿瘤是一种细胞周期疾病,本质在于细胞周期调节失控,细胞呈无限制增殖和分裂,G1→S期调控点非常重要。目前认为,以Cyclins/CDKs/CKI/pRb为核心的G1/S期细胞周期网络调控系统,是肿瘤发生中最常改变的共同通路,作用于细胞周期的G1→S期调控点[4]。
Rb 是周期素D依赖性激酶的首要底物,在调节G1进程中发挥关键作用,是控制限制位点分子网络的关键分子。目前认为,生长信号传入核内,激活CyclinD1的启动子,从而使CyclinD1表达水平上升,与CDK4/6结合并激活后者的活性。活化的CyclinD1-CDK4/6复合物能摄取大量磷酸基团,并将它们转移到控制细胞周期“限制点”的重要分子Rb上,从而磷酸化灭活Rb,Rb能够结合和抑制不同E2F家庭成员的转录活性,控制 S期的关键步骤是转录因子E2F家族的激活,这些转录因子启动了细胞周期进入S期所需蛋白的转录,直接调节细胞增殖和DNA合成的基因[5-6]。
结果可以看出温下方含药血清对肺癌A549细胞具有明显的抑制作用,其机制可能通过降低PCNA表达,抑制肿瘤细胞的快速增殖。温下方含药血清还可能通过降低CyclinD1的表达,减少Rb磷酸化灭活,延迟细胞周期进入S期细胞的转录,进而影响A549细胞的增殖。
参考文献
[1] 季旭明,欧阳兵,张桂菊,等.温下方对Lewis肺癌的抑制作用及对细胞周期的影响[J] ......
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