蝉拟青霉不同纯化组分对体外抗肿瘤作用的基础研究(2)
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参见附件。
1.1 仪器
[BW(S(Z,1,2)MD2]
[WT5”FZ〗中华中医药学刊
TU-1800PC紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。高效液相色谱仪Shimadzu LC-20AT型、SPD-20A(VWD检测器),N2000工作站。CO2培养箱(德国Heraeus公司),流式细胞仪(型号FACS Calibur,美国BD)。荧光倒置显微镜(Olympus)等 。
1.2材料
腺苷、虫草素对照品:由中国药品与生物制品检定所提供。CycleTest细胞周期试剂盒(美国BD公司),RPMI 1640培养液(美国GIBCO),小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所),(简称DDP,云南个旧生物制药有限公司产品,批号:070101),阿霉素(简称ADM,浙江海正药业股份有限公司,批号071105),总多糖和总腺苷(由浙江省医学科学院药物研究所天然药物研究室提供,苯酚硫酸法检测,未减去水分含量的蝉花中总多糖含量为51.6%,蝉花总多糖中的水分含量为8.7%。蝉花中腺苷在210 nm检测时,纯度为19.88%;在260nm检测时,纯度为31.82%。),CD25,CD19,CD3,CD4,CD8,CD56,CD44抗体(美国BD)淋巴细胞分离液,PBS缓冲液,RPMI 1640培养液(美国GIBCO)等,1.3细胞株
人细胞肺癌细胞系PAA-1。
2方 法
MTT法检测DDP、ADM、总多糖、总腺苷单独及联合用药对人肺腺癌(PAA-1)细胞的生长抑制能力。
2.1 实验分组
DDP采用浓度为0.3125μg/mL,0625μg/mL,1.25μg/mL,2.5μg/mL,5.0μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL,80μg/mL和160μg/mL;ADM采用浓度为0.25μg/mL,0.5μg/mL,1.0μg/mL,2.0μg/mL,4.0μg/mL,8.0μg/mL,16μg/mL和32μg/mL;总多糖采用浓度为:0.3125mg/mL,0.625mg/mL,1.25mg/mL,2.5mg/mL,50mg/mL和10.0mg/mL;腺苷采用浓度为:0.0625mg/mL,0125mg/mL,0.25mg/mL,0.5mg/mL,1.0mg/mL,2.0mg/mL,4.0mg/mL,80mg/mL,16mg/mL和32mg/mL;DDP与多糖联合作用,分别为:阴性对照组,DDP16.0μg/mL,DDP 8.0μg/mL,DDP 40μg/mL,DDP 2.0μg/mL,DDP 16.0μg/mL+多糖5mg/mL,DDP 8.0μg/mL+多糖5mg/mL,DDP 4.0μg/mL+多糖5mg/mL,DDP 2.0μg/mL+多糖5mg/mL;DDP与多糖联合作用,分别为:阴性对照组、ADM16.0μg/mL、ADM 8.0μg/mL、ADM 4.0μg/mL、ADM 2.0μg/mL、ADM 16.0μg/mL+多糖5mg/mL、ADM 8.0μg/mL+多糖5mg/mL、ADM 4.0μg/mL+多糖5mg/mL、ADM 2.0μg/mL+多糖5mg/mL;DDP与腺苷联合作用,分别为:阴性组、DDP 8.0μg/mL、腺苷8mg/mL、腺苷05mg/mL、腺苷0.25mg/mL、DDP8.0μg/mL+腺苷8mg/mL、DDP 8.0μg/mL+腺苷0.5mg/mL、DDP8.0μg/mL+腺苷0.25mg/mL;ADM与腺苷联合作用,分别为:阴性组,ADM40μg/mL、腺苷8mg/mL、腺苷0.5mg/mL、腺苷0.25mg/mL、ADM4.0μg/mL +腺苷8mg/mL、ADM4.0μg/mL +腺苷0.5mg/mL、ADM4.0μg/mL +腺苷0.25mg/mL。
2.2细胞实验处理
对数生长期PAA-1细胞用025%胰酶+0.02%EDTA消化后悬液配成7×105/mL,96孔板每孔加100μL,每孔7000细胞,培养24h后加药处理。每个处理组设6复孔。阴性对照组加100μL培养液;依照各实验分组加不同浓度药物,各孔终体积为200μL;处理24h后加20μL MTT,37℃ 5%CO2培养4h后离心,小心弃去上清,加150μL二甲基亚砜,微振荡1min使之充分溶解,酶标仪双波长(570nm/690nm)检测吸光度OD值。
2.3数据处理
对各组OD值取平均值,计算抑制率(IR)。药物抑制率= (1-药敏组平均OD值/阴性组平均OD值)×100%。对结果应用直线回归法分析IC50,并作相关性分析求r值。
2.4对体外培养细胞系细胞周期的影响
细胞分成15组,分别为:阴性组,腺苷8.0mg/mL组,腺苷0.5mg/mL组,腺苷0.25mg/mL组,DDP 8.0μg/mL组,DDP 8.0μg/mL+腺苷8mg/mL组,DDP 8.0μg/mL+腺苷0.5mg/mL组,DDP 8.0μg/mL+腺苷0.25mg/mL组,ADM 4μg/mL组,ADM 4μg/mL+腺苷8mg/mL组,ADM 4μg/mL+腺苷0.5mg/mL组,ADM 4μg/mL+腺苷025mg/mL组,多糖5mg/mL组,DDP 8.0μg/mL+多糖5mg/mL组,ADM 4μg/mL+多糖5mg/mL组 ......
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