中肺合剂对小鼠Lewis肺癌肿瘤组织SurvivinCaspase-3表达的影响(2)
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参见附件。
1.4主要试剂
PBS磷酸盐缓冲液(ZLI-9062,北京中杉金桥生物技术有限公司);Survivin兔源单克隆抗体(一抗,批号:A0609,美国Santa Cruz公司),Caspase-3兔源单克隆抗体(一抗,批号:J1107,美国Santa Cruz公司);兔两步法试剂盒(二抗,PV-6001,批号:4587,英国invitrogen公司;DAB显色试剂盒(ZLI9032,20×,批号:457500A,英国invitrogen公司)。
1.5主要仪器
OLYMPUS-CKX41倒置万能显微镜(日本奥林巴斯公司);Leica DMLB光学显微镜(德国Leica公司);STP120脱水机(MICROM公司);AP280-2包埋机(MICROM公司);HM335E切片机(MICROM公司);AB104-N电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);BG-270DRP-9052电热恒温箱(上海森信实验仪器有限公司);GNP-9080隔水式电热恒温箱(上海精宏实验设备有限公司)。
1.6实验方法
1.6.1 模型制备与分组 取接种Lewis 肺癌10～14天的C57BL/6荷瘤小鼠,脱颈椎处死,无菌条件下取瘤组织,按肿瘤质量(g)与生理盐水(mL)1∶3制备瘤细胞悬液,200目细胞筛过滤,1500r/min,5min,用生理盐水调节成浓度约1×107•mL-1肿瘤细胞浓度。取50只小鼠,雌雄各半,在右前腋皮下接种Lewis肺癌瘤细胞悬液,每只0.2mL。并随机分成5组:A组:荷瘤(生理盐水)对照组;B组:中肺合剂低剂量组;C组:中肺合剂中剂量组;D组:中肺合剂高剂量组;E组:环磷酰胺化疗组。
1.6.2 给药方式 本次实验拟定小鼠低、中、高给药剂量(以制备时投入生药计算)分别为12.7g•kg-1•d-1,25.4 g•kg-1•d-1,50.8 g•kg-1•d-1。采用给小鼠灌胃的给药方法,一次灌胃体积为0.4mL,每日1次。配制成相应的低、中、高给药浓度分别是0.635 g•mL-1、1.27g•mL-1、2.54g•mL-1,相当于成品中肺合剂的1倍、2倍、4倍。造模后24 h开始灌胃给药,A组用生理盐水0.4 mL/只,每日1次;B、C、D组以低、中、高剂量灌胃0.4mL/只,每日1次;E组以环磷酰胺腹腔注射,30mg•kg-1,每周2次。共观察12天停药。
1.6.3肿瘤组织石蜡标本的制作 停药次日处死动物,剥离皮下瘤体,用10%中性甲醛固定24h。取肿瘤组织切成小块(横断面厚度0.2cm左右)。二次固定30min(10%中性缓冲福尔马林)后流水冲洗30min。经脱水→透明→浸腊→包埋,制成肿瘤组织石蜡标本。
1.6.4EnVision两步法免疫组化染色 将蜡块用切片机切片,每例蜡块连续切片3张备用,厚度4~5μm。切片经脱蜡→水洗→高压热修复→内源性过氧化物酶的阻断→PBS清洗→滴加一抗(37℃孵育60min,稀释倍数均为1∶100)→PBS清洗→滴加二抗(37℃孵育45min)→PBS清洗→DAB显色→复染、透明后封片。
1.6.5结果判定 免疫组化染色采用EnVision法。PBS代替一抗作空白对照,已知阳性片作阳性对照。细胞染色强度明显高于背景,Survivin、Caspase-3表达位于胞浆,呈棕黄色颗粒者为阳性细胞。参照王艳等[1]光镜下半定量评定标准计分。染色强调分数标准为:无着色0分;淡黄色为1分;棕黄色为2分;棕褐色3分。然后选取代表性的区域,计数5个高倍视野(400×)下阳性细胞所占的百分比,无着色细胞为0分;≤10%为1分;11%~50%为2分;51%~75%为3分;>75%为4分。两项得分相乘:0~3分为阴性表达“-”;大于3分为阳性表达“+”。
1.6.6统计学处理 运用SPSS 16.0软件对相关数据进行统计学处理。计量资料采用±s表示,两组间计量资料比较采用t检验,两组间率的比较采用χ2检验(Fisher’s精确检验)。
2结果
2.1 中肺合剂对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织survivin蛋白表达的影响
各组survivin阳性细胞数量及表达强弱不一。生理盐水组阳性表达率为90%,阳性细胞数量多而密,细胞着色深,以棕褐色为主,阳性信号表达强;CTX化疗组阳性表达率分别为20%,阳性细胞数量最少,细胞着以无色和淡黄色为主,阳性信号表达弱;低剂量组阳性表达率为70%,阳性细胞数量较多,细胞着以棕褐色、棕黄色占多,阳性信号表达较强;中剂量组阳性表达率分别为40%,阳性细胞数量中等,细胞着色以淡黄色为主,阳性信号表达较弱。高剂量组阳性表达率为50%,阳性细胞数量较多,细胞着以棕黄色和淡黄色居多。具体结果见表1和插页Ⅱ图1。与生理盐水组积分相比,中、高剂量组和化疗组有非常显著差异(P<0.01),而低剂量组则无显著性差异(P>0.05)。
表1中肺合剂对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织Survivin/Caspase-3蛋白表达的影响
组别剂量动物数(n)Survivin
积分阳性率%
Caspase-3
积分阳性率%
NS组20mL•kg-1107.8±3.48901.3±1.4120
低剂量组12.7g•kg-1105.3±2.57702.4±2.0530
中剂量组25.4g•kg-1102.7±2.05**405.4±2.65**70
高剂量组50.8g•kg-1103.6±2.57**502.6±1.20*40
CTX组30mg•kg-1101.6±1.49**207.8±2.89**90
注:与生理盐水组相比*P<0.05;**P<0.01。
2.2中肺合剂对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织caspase-3蛋白表达的影响
各组caspase-3阳性细胞数量及表达强弱不一。生理盐水组阳性表达率为20%,细胞无着色或淡黄色,阳性信号表达弱;CTX化疗组阳性表达率为90%,细胞着色深,以棕褐色为主,阳性信号表达强;低剂量组阳性表达率为30%,阳性细胞数量较少,细胞着色以无着色或淡黄色为主,阳性信号表达较弱;中剂量组阳性表达率分别为70%,阳性细胞数量多,细胞着较深,以棕褐色、棕黄色为主,阳性信号表达较强;高剂量组阳性表达率为40%,阳性细胞数量较少,细胞着以棕黄色为主,阳性信号表达较弱。具体结果见表1和插页Ⅱ图2。与生理盐水组积分相比,中剂量组和化疗组有非常显著差异(P<0.01),高剂量组显著性差异(P<0.05),而低剂量组则无显著性差异(P>0.05)。
3分析与讨论
多细胞生物的细胞死亡有两种方式,即细胞坏死和细胞凋亡 ......
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