桂枝茯苓胶囊对体外人宫颈癌Hela细胞抑制作用及机理研究(2)
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参见附件。
2.2.2 免疫组化检测对人宫颈癌细胞Hela的Fas Fas-L BCL-2蛋白表达SABC法:取实验组6孔培养板里盖玻片,0.01MPBS漂洗3次,湿盒内10%中性福尔马林缓冲固定30分钟,PBS漂洗;H2O2+甲醇(1∶50)浸泡15min,PBS洗去浸泡液;加封闭液室温放置20min,甩去多余的液体;加一抗(Fas、Fas-L、Bcl-2 )37℃培养1h,PBS洗2min×3次,加二抗(生物素化羊抗兔IgG)20℃,20min,PBS漂洗;加SABC(1mL蒸馏水+ABC各一滴混匀),20℃,20min,PBS漂洗。苏木素轻度复染,分别用30%、50%、70%、80%、90%乙醇脱水每次2min、二甲苯透明,显微观察Fas、Fas-L、Bcl-2的表达。
2.2.3 western-blot检测对人宫颈癌Hela细胞caspase-3的表达抽提实验组25mL培养瓶细胞蛋白:加700μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,经常摇一摇,使细胞充分裂解。收集裂解液体,4℃,12000r/min离心5min,取上清分装Eppendorf管中。Lowry法测定蛋白浓度。
取15μL左右(约含蛋白40μg)SDS-PAGE电泳分离后电转移到硝酸纤维膜。取出膜用5%脱脂奶粉室温封闭2h后,用含 0.05%Tween 20的TBS缓冲液(TBST)漂洗3次,每次 10min,加兔抗人Caspase-3多克隆抗体(1∶1000)4℃孵育过夜,TBST漂洗3次后加相应的生物化素羊抗兔二抗(1∶500),37℃摇床温育2h,DAB显色系统显色,拍照。
2.2.4 RT-PCR检测对人宫颈癌Hela细胞Caspase-3的表达按TRIzol试剂说明书提取实验组25mL培养瓶细胞RNA,紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度,纯度要求为OD260/OD280>1.8,将浓度调整为0.2μg/μL,提取的总RNA进行cDNA合成。
RT-PCR反应条件:混匀后42℃1 h,95℃加热5 min,快速冷却到4℃。反转录所得的cDNA用作PCR反应的模板,-20℃保存备用。PCR扩增反应体系及条件:Caspase-3∶94℃ 5min预变性,94℃45s,52℃45s, 72℃1min,30个循环; 72℃延伸10 min,产物4℃保存[4]。
扩增产物经25 g/L琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统进行拍照分析。
2.2.5 DNA Ladder检测凋亡条带按DNA ladder抽提试剂盒说明书提取实验组25mL培养瓶细胞DNA,测定DNA浓度。
取5μL样品加入1μL Loading Buffer,1.5%琼脂糖凝胶电泳75V/cm 电泳45 min,凝胶图像处理系统观察拍照。
3 结 果
3.1 对人宫颈癌Hela细胞生长抑制作用
桂枝茯苓胶囊40μL时对Hela有抑制作用(P<0.01)结果见表1。
表1 桂枝茯苓胶囊对Hela抑制作用(n=6,±s)
组别用药量ul平均吸光度(A)抑制率(%)
空白对照─2.5730±0.105
阿霉素101.3530±0.179 147.41
桂枝茯苓胶囊400.8596±0.133 1,236.47
注:与空白对照组比较,1P<0.01;阿霉素组和桂枝茯苓胶囊组比较,2P<0.01
3.2 对人宫颈癌Hela细胞Fas Fas-L Bcl-2 的表达
免疫组织化学染色显示,空白对照组肿瘤细胞数量多,Fas和Fas-L染成棕黄色较少(见图1、3);桂枝茯苓胶囊组大多数肿瘤细胞的胞质和胞膜均有Fas、Fas-L蛋白阳性表达,呈棕黄色颗粒,多为灶状分布或单个细胞散在分布(见图2、4);Bcl-2蛋白在空白对照组较多肿瘤细胞的胞质和核膜呈阳性表达,阳性细胞多呈灶状分布,少数细胞呈散在分布(见图5);桂枝茯苓胶囊组只有少数细胞质和核膜有Bcl-2蛋白阳性表达,且阳性细胞多散在分布(见图6)。
图1 空白组Fas表达
图2 桂枝茯苓胶囊组Fas表达
图3 空白组Fas-L表达
图4 桂枝茯苓胶囊组Fas-L表达
图5 空白组bcl-2表达
图6 桂枝茯苓胶囊组bcl-2表达
3.3对人宫颈癌细胞Hela Caspase-3的表达
DAB在硝酸纤维素膜上显色后,100μL和300μL桂枝茯苓组都有棕褐色条带,且300μL桂枝茯苓组Caspase-3的条带比100μL桂枝茯苓组条带淡,见图7。
M:32KD Caspase-3;1:预染Mark;2:100μL桂枝茯苓胶囊;
3:300μL桂枝茯苓胶囊;4:300μL桂枝茯苓胶囊
图7western-blot检测Hela细胞capase-3条带
对人宫颈癌细胞Hela Caspase-3的表达PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,约400bp处见到条带,与设计引物相符,300μL桂枝茯苓胶囊药液比150μL和100μL桂枝茯苓胶囊药液条条带要亮。空白对照组mRNA的表达量明显少于以上各组。结果见图8。
M:400bp Caspase-3 mRNA;1:桂枝茯苓胶囊300μL组;
2:桂枝茯苓胶囊300μL组;3:桂枝茯苓胶囊150μL l组;
4:桂枝茯苓胶囊150μL组;5:桂枝茯苓胶囊100μL组;
6:桂枝茯苓胶囊100μL组;7:空白对照组
图8 RT-PCR检测桂枝茯苓胶囊对人宫颈癌细胞Hela Caspase-3的表达
3.4 DNA-Ladder
桂枝茯苓胶囊两个剂量组处理36h后,电泳凝胶处理系统中出现DNA梯带,见图9。
图9 DNA-Ladder检测Hela细胞DNA 凋亡条带
4 讨 论
肿瘤的发生是由于细胞增殖和凋亡失调而导致细胞无限增殖所致。肿瘤细胞凋亡及其增殖抑制成为评估抗癌药物作用能力的重要指标[5] 。
细胞凋亡过程受到一系列相关基因的调节和控制[6]。目前发现与细胞凋亡有关的基因包括Fas、Fas-L、Bcl-2、p53、 Bax、Cmy-c、等[7]。Fas位于细胞膜上,属于TNF受体家族成员,Fas配体与表达Fas的细胞结合即可导致细胞凋亡,以抗Fas抗体与之交联,即可导致典型的细胞凋亡[8]。Bcl-2是凋亡抑制基因,以同源或异源二聚体的形式调节细胞凋亡。细胞凋亡时,内源性核酸内切酶被激活,该酶切开DNA的核小体连接区,形成若干180～200bp大小或其整倍数的寡核苷酸片段,琼脂糖凝胶电泳时,呈现“阶梯状电泳条带”(即DNA ladder),作为判断凋亡的客观指标之一[9] 。
半胱天冬氨酸蛋白酶(caspase)是细胞凋亡的效应蛋白,caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡的执行者,它广泛分布于各种类型的细胞中。caspase-3在细胞中以无活性的酶原形式存在,激活后列解成有活性的分子量17KD和12KD的亚单位[10-11] ......
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