应用双向凝胶电泳分析掌叶半夏总蛋白对人卵巢癌SKOV3细胞蛋白质表达谱的影响(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
Key words:protein of Pinellia pedatisecta Schott; ovarian cancer; two-dimensional gel electrophoresis;Proteome
掌叶半夏为天南星科植物掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott)的块茎,它是中药天南星的主要来源之一,即虎掌南星。70年代初,上海第一医院妇产科研究发现掌叶半夏具有抗宫颈癌作用。之后孙光星等[1]进一步研究发现其蛋白成分对S-180小鼠肉瘤有明显抑制作用。朱铭伟等[2]观察到掌叶半夏总蛋白对多种卵巢癌细胞株有明显抑制作用,同时没有显示对人脐血造血细胞有抑制作用,提示掌叶半夏总蛋白可作为治疗卵巢癌的有效中药,但因其作用机理不清,限制了其应用。为了进一步研究其抗肿瘤的作用机制,为研究开发新药提供理论依据,本实验借助双向凝胶电泳(2-DE)观察掌叶半夏总蛋白处理前后SKOV3细胞蛋白表达谱的差异,为探寻掌叶半夏总蛋白抗卵巢癌作用的相关蛋白奠定基础。
1 材 料
1.1细胞株人卵巢癌SKOV3细胞株购自中国科学院上海生命科学研究所。在含青霉素,链霉素的双抗、10%胎牛血清的McCoy’s 5A的培养液37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养,每2～3天传代1次。
1.2掌叶半夏总蛋白的制备新鲜掌叶半夏购自河南许昌地区。将洗净去皮的掌叶半夏加生理盐水匀浆,经丙酮梯度沉淀得到的掌叶半夏粗蛋白,再在4℃蒸馏水中透析48h,高速离心后取上清液为最终提取的掌叶半夏总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。
1.3主要试剂和仪器McCoy’s 5A:吉诺生物医药技术有限公司,Gibco公司分装。胎牛血清:杭州四季青有限公司。胰蛋白酶:Gibco公司。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、超纯尿素 (ultraurea)、硫脲 ( thiourea)、 32[32(胆酰胺基丙基 )二甲氨基 ]丙磺酸盐 (CHAPS)、四甲基乙二胺(TEMED)、二硫苏糖醇 (DTT)、碘乙酰氨、固相pH干胶条(17 cm, pH 3～10),Bi o-lyte pH 3～10,2-D clean up试剂盒等 (Bi o- Rad公司 );蛋白酶抑制剂混合液( Sigma公司 ),所有溶液均用 Milli Q水配制。PROTEAN IEF CELL等电聚焦仪 , PROTEANIIXi垂直板电泳仪及其附件,GS2 800扫描成像系统 , PDQuest凝胶图像分析软件 (Bi o-Rad公司 ),UV2800紫外可见分光光度计 (上海尤尼柯公司 )。
2 方 法
2.1掌叶半夏总蛋白半抑制浓度的检测取对数生长期的SKOV3细胞以5000个/孔接种于96孔培养板,24h后分别加入不同浓度的掌叶半夏总蛋白(0.8,4,20,100,200,300,400μg•mL-1),继续培养72h,加入CCK-8,孵育1h,用自动酶标检测仪以630nm为参比波长,在450nm处测定A值(吸收度),镜下观察。以单加培养液为空白对照,不加任何药物的含细胞培养液为阴性对照。每组设复孔6个。应用直线回归法计算半数抑制浓度值(IC50)。
2.2细胞收集SKOV3细胞长至对数生长期后,换培养基,处理组细胞暴露于半数抑制浓度的掌叶半夏总蛋白中,5 %CO2的培养箱中37℃培养30h后,加入1mL消化液(025%胰蛋白酶及0.02% EDTA)消化,然后加10mL培养液终止消化,制成单细胞悬液,计数后用预冷的 PBS漂洗细胞两次,倒掉 PBS后每瓶重新加入1mL PBS,用细胞刮将细胞层小心刮下,PBS重悬细胞,转移至2mL的离心管内,将盛有细胞的离心管 2000r/min离心,4℃,10min,弃上清,每管加入2mL PBS,再次 2000r/min离心,4℃,10min,弃上清,放入 - 80℃冰箱冻存。未处理组依常规收集。
2.3细胞总蛋白质的抽提1.5×106细胞加入 200μL细胞裂解液 ( 7mol/L Urea, 2mol/L Thiourea,l4 % CHAPS,40mmol/L Tris,65mmol/L DTT, 5mmol/L PMSF,1mg/mL DNaseⅠ,0. 25mg/ mL RNase A)中,静置 30min,间断涡旋震荡,15000r/ min、 4℃离心 30 min,吸取上清液。取少量上清用二喹啉甲酸(BCA)蛋白质定量试剂盒测定总蛋白的浓度。其余上清液冻存于-80℃备用。
2.4双向凝胶电泳
参考文献[3]方法,根据样品情况适当改进。第一向—等电聚焦:将200μg样品与上样缓冲液(7mol /L尿素,2mol/L硫脲, 4% CHAPS,65 mmol / L DTT,0.2% BioLyte,0.001%溴酚蓝)混合后开始等电聚焦。聚焦后的胶条依次在含 1% DTT和 4%碘乙酰胺的平衡缓冲液 ( 6 mol /L尿素,2% SDS,50 mmol /L Tris-HCl pH 8.8,20%甘油)中各平衡15 min,转移至 12%聚丙烯酰胺凝胶的上端,琼脂糖封顶。第二向—SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE):以恒流 10 mA /gel电泳15 min,再加大电流至30 mA /gel直至溴酚蓝达到胶的底端。参照文献[4]方法银染。
2.5凝胶图像的采集和分析 用 GS-800透射扫描,分辨率为 63.5×63.5 microns。图像配比分析采用 PDQuest7.4.0分析,比较蛋白质点差异。
3 结 果
3.1掌叶半夏总蛋白对SKOV3细胞增殖的影响20μg•mL-1的掌叶半夏总蛋白即能显著抑制SKOV3细胞的体外生长,随着剂量的增加,抑制作用逐渐增强,呈明显的剂量-效应关系。利用曲线拟合计算其72h的IC50为82.396μg•mL-1。
3.2双向凝胶电泳图谱分析在相同条件下对来自掌叶半夏总蛋白处理组和未处理组的SKOV3细胞总蛋白样品各重复3次双向凝胶电泳,肉眼观察表明,3次双向电泳图谱非常相似,掌叶半夏总蛋白处理组蛋白质斑点少于未处理组,蛋白质点大部分分布在等电点PH3-5和PH7-10之间,分子量在14.4-112KD之间较为均匀分布。用PDQuest软件分析,其中未处理组 3张图找到蛋白质点(964±6)个,匹配率平均为 99%;掌叶半夏处理组找到蛋白质点(883±20)个,匹配率平均为96%,具有较好的重复性。蛋白质双向电泳图谱见图1。筛选出差异蛋白质点550个,其中154个表达上调,178个表达下调,96个仅在未处理组表达,122个仅在掌叶半夏总蛋白处理组表达 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2639kb)。