丹参联合骨髓间充质干细胞静脉移植对兔心肌梗死区血管再生影响的实验研究(2)
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参见附件。
1 材料与方法
1.1实验动物的选择与分组
动物采用日本大耳白兔,体重在2～3kg,2～3个月龄,雌雄不限,购自于辽宁中医药大学实验动物中心。将53只日本大耳白兔随机分为:正常组(10只),造模组45只,根据复制模型成功率(预实验的最低造模成功率70%计算),将造模组心肌梗死模型复制成功后观察24 h,存活者随机分为B组:模型组(10只),C组:静脉7天注射干细胞组(10只),D组:静脉7天注射干细胞联合丹参组(10只)。组间体重差异无显著性(2.4±0.3)kg、(2.5±0.2)kg、(2.3±0.3)kg、(2.5±0.3)kg,P<0.05。
1.2 药品与试剂
1.2.1药品 丹参注射液,剂型:冻干粉针剂,规格与包装:0.4g×1支(哈药集团中药二厂)。
1.2.2试剂 乌拉坦,分析纯,4%多聚基甲醛,分析纯,(沈阳试剂二厂);间充质干细胞培养基及间充质干细胞培养基添加物、Ficoll-paque plus、PBS含2%FBS、PBS不含FBS、胰酶-EDTA.培养瓶斜口;离心机;流式细胞仪等。
1.3器材
心肌梗死造模器材:兔手术固定台、心电图机;手术器材包括手术刀、持针器、眼科剪、瓦式拉钩(以上器材均由本校针灸学院电生理实验室提供);无损伤冠脉结扎针线、普通缝合针线等等。
2实验方法
2.1 骨髓间充质干细胞的获得
取健康日本大耳白兔2只,经胫骨平台抽取骨髓,进行间充质干细胞分离、培养、传代、鉴定、收集、标记。
2.2急性心梗动物模型制备
①麻醉;②做术前心电图;③备皮;④开胸;⑤结扎:⑥术后心电图;⑦关胸;⑧抽血。
2.3模型干预
造模成功7天后C组予干细胞混悬液2×106静脉1次性注射。D组予静脉注射丹参注射液(154mg/kg),连续注射10天,联合应用与C组等量的干细胞。
2.4 标本采集
2.4.1 采血 于术后24h和第5周经耳中动脉采血,离心(3000r/min),用于ELASA(夹心酶联免疫)法检测VEGF。
2.4.2 取心脏组织 术后第5周,麻醉动物,于活体下迅速取出心脏。并于30s内迅速切下梗死及梗死周围区心肌组织,用4%多聚甲醛固定以备免疫组化。
2.5观察指标
免疫组化观察:CD31,VEGF的表达;血清学检测VEGF的表达。
2.6阳性结果判定
梗死区组织中有棕褐色阳性细胞聚集区。
2.7统计学方法
所有数据采用±s表示 ,采用单因素方差分析和进行统学处理。应用 SPSS 11.0软件,P<0.05为差异有显著性。
3 结 果
3.1 急性心肌梗死造模结果
结扎冠脉前与结扎冠脉后心电图的比较结果
在结扎兔前降支(LAD)冠脉后,胸前导联V2、V5,ST段有一定程度的抬高,提示前壁心梗,心电图证实急性心梗模型制备成功见图1～2。
图1造模前
图2造模后24h
3.2 免疫组化染色结果
3.2.1CD31染色显示 在光学显微镜下观察可见图3～图6:血管内皮细胞呈棕褐标记,积分光密度值统计分析结果显示:与正常组比较,模型组明显降低有统计学意义(P<0.01),静脉7天注射干细胞组和静脉注射干细胞联合中药组虽有降低但无统计学差异(P>0.05);与模型组比较,各组均明显高于模型组有统计学差异(P<0.01);与静脉7天注射干细胞组比较,静脉7天注射干细胞联合中药组表达降低但无统计学差异(P>0.05),见表1。
图3 CD31正常组
图4 CD31模型对照组
图5 CD31静脉7天注射干细胞
图6 CD31静脉7天注射干细胞+中药组
3.2.2 VEGF染色 在光学显微镜下观察可见图7~8:各组均有散在的阳性表达,但各组间无统计学意义(P<0.05),见表1。
图7 正常组VEGF
图8 模型组VEGF
表1免疫组化CD31 VEGF(±s )
组别nCD31VEGF
正常组922.63±11.90▲▲33.06±23.93
模型组711.28±7.60**△△■■31.89±18.91
静脉7天注射干细胞组721.20±11.00▲▲31.10±21.69
干细胞合并中药组717.78±9.40▲▲25.87±18.65
注:与正常对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较▲P<0.05,▲▲P<0.01;与静脉7天注射干细胞组比较,△P<0.05,△△P<0.01;与静脉注射干细胞合并中药组比较■P<0.05,■■P<0.01。
3.3 血清中VEGF水平
术后5周比较血清中VEGF含量,各组间比较无统计学意义(P>0.05),见表2。
表2 血清VEGF
组别nVEGF
模型组724.60±5.13
静脉7天注射干细胞组724.84±12.81
静脉7天注射干细胞合并中药组729.92±6.27
4 分析讨论
目前急性心肌梗死的治疗是通过药物治疗减少心肌耗氧、扩血管改善心肌血液供应;通过调控危险因素防止病变进展,但无法改善梗死区心肌血供,挽救濒死心肌组织;通过介入或手术治疗恢复局部冠状动脉血流来进行血运重建,使部分AMI患者的临床症状和远期预后得到明显改善,但也有其局限性、手术风险和术后并发症等。因此有必要寻找血运重建的其他策略以减轻AMI的症状和改善心肌缺血,挽救濒死的心肌[2]。
骨髓间质干细胞(MSC)是具有可扩增性和多向分化性。同时MSC来源广泛,移植后不易发生免疫排斥反应[3-5]。自2001年Orlic等[6]发现MSCs可在一定条件下分化为心肌细胞以来,现已明确还具有分化为心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞的潜能。
丹参是我国的传统活血化瘀中药,现已发现具有抑菌、抑肿瘤、抗凝血以及改善微循环等作用[1] ......
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