壮骨镇痛胶囊对乳腺癌细胞迁移运动信号通路关键蛋白p-JNK和Rac-1表达的影响(2)
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参见附件。
1.1.3 仪器设备双人单面净化工作台(苏净集团),AE31型倒置显微镜(Motic公司),96孔,24孔,6孔培养板(Corning公司),微孔滤器(Pall公司),超纯水制备器 (Molecular),超声波清洗器(上海新苗医疗器械公司),MK3型酶标分析仪(Thermo Labsystems 雷勃公司),EBA12R 低温离心机(美国Beckman),CO2培养箱(美国Nuaire)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
参考文献[5]进行。复苏后接种于含15%胎牛血清RPMI-1640培养液中,在37℃、5%CO2条件下培养。
1.2.2 壮骨镇痛胶囊药物血浆的制备选用正常SD大鼠30只,随机分为药物组和生理盐水对照组,每组15只,自由饮水,摄食,保持自然光照饲养1周后,药物组灌胃壮骨镇痛胶囊,按人与动物用药剂量换算公式[大鼠剂量(g/kg)=6.25×成人剂量(g)/成人体重(60kg)]计算出一般给药量,该实验中的给药量为一般用量的3倍,对照组用等体积生理盐水灌胃。每天灌胃1次,连续7天;最后1天灌胃2次,间隔1h,末次给药后1h颈动脉采血,离心,取上清(即药物血浆),同组动物血浆混匀,经0.45μm过滤器过滤除菌,-20℃保存备用。
1.2.3 细胞迁移实验参照文献[6]进行。收获对数生长期的MDA-MB-231细胞,将细胞密度调整为5×105个/mL,接种于6孔板中,每孔3mL,待其贴壁后融合度约为85%~90%时,改为无血清RPIM-1640培养液继续培养24h后,吸弃培养液,用200μ L的tip头在孔内侧底面的中部从上向下均匀用力划一条宽度相等的细胞刮除带,并在底外面以蓝色记号笔划3条与刮出带垂直的线,换以高(5.00%)、中(1.25%)、低(0.63%)不同浓度含药血浆培养液,并且各药物组的培养液中分别加入正常大鼠血浆,使其最终血浆浓度均为5.00%,同时以5.00%正常大鼠血浆培养液作为对照组,每组设5个复孔,以划带时间为0 h,在倒置显微镜下分别观察0 h、24 h划带的宽度,每孔取3处划带宽度值求平均值,再求出每组24h 的细胞实际迁移距离平均值,比较各组细胞的迁移抑制率。
迁徙抑制率=(1一实验组迁徙距离/对照组迁徙距离)×100%
1.2.4 免疫细胞化学法将细胞按2×104/mL接种于24孔培养板内(1mL/孔),孔内预置无菌圆盖玻片。待细胞贴壁后,改为无血清RPMI-1640培养基继续培养24h,吸弃培养液,分别加入不同浓度药物血浆培养液,处理24h后,吸弃培养液,D-Hank’s液洗3次,80%的冰丙酮固定15～20min,弃丙酮,待玻片自然干燥后,参照文献[7]采用SABC法检测各蛋白水平。采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统摄像和进行图像分析,每个细胞玻片共检测5个阳性视野和5个阴性视野,取平均值,每组6次重复。以阳性视野和阴性视野灰度值的比值表示蛋白表达水平的高低,比值越高,蛋白表达水平越低。
1.2.5 统计学方法应用SPSS 16.0软件包对数据进行统计学处理。计量资料结果用均数±标准差(±s)表示,多组比较采用单因素方差分析,并进行组间的多重比较,方差齐,采用LSD法;方差不齐,则采用Tamhane’s T2法比较。显著性检验取双侧界值点,P<0.05时差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 不同浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆对MDA-MB-231细胞迁移的影响
与对照组比较,高、中浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆组乳腺癌细胞实际迁移距离明显减短(P<0.05),说明此两组均能显著抑制乳腺癌细胞的迁移运动,低浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆组细胞实际迁移距离无明显变化,暗示低浓度药物血浆对乳腺癌细胞的迁移运动无明显影响,见图1。
不同浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆对MDA-MB-231细胞迁移
2.2 不同浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆对MDA-MB-231细胞 p-JNK和Rac-1蛋白活性的影响
与对照组比较,高、中浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆组p-JNK和Rac-1蛋白水平显著降低(P<0.01),低浓度组p-JNK和Rac-1蛋白表达水平无明显变化,并且p-JNK和Rac-1蛋白表达水平在高、中浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆组与低浓度组之间的差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05),见表1。
3 讨 论
细胞迁徙在癌症、动脉粥样硬化等疾病中多见,阻止细胞迁移能延缓甚至抑制疾病的发展。国内外学者对各种肿瘤细胞的形态学进行了观察[8-10],认为肿瘤细胞的运动性与转移有密切关系。细胞迁移过程的每一步都需要有一系列的生化级联反应如细胞极性、微丝和微管的解聚和聚合
表1壮骨镇痛胶囊对MDA-MB-231细胞p-JNK和Rac-1蛋白的影响(n=6,±s)
组别含药血浆浓度(%)p-JNK灰度值比值Rac-1灰度值比值
对照组00.622±0.0370.666±0.044
高浓度组5.000.701±0.022**0.753±0.036**
中浓度组1.250.727±0.019**0.719±0.059*
低浓度组0.630.652±0.022△□□0.655±0.028△□
统计量F值-20.2476.768
P -0.0000.002
注:与对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与高浓度组比较△P<0.01;与中浓度组比较□P<0.05,□□P<0.01。
动态过程的调控、迁移过程中信号转导在时间和空间上的变化等[11]细胞迁移机制。肿瘤细胞的丝状伪足能够使癌细胞牢固地固定于器官表面,并沿器官表面移动及沿细胞之间的间隙向器官内移动[12]。侵袭部分癌细胞丝状伪足与器官表面突起部分连接或与靶细胞直接黏附,还有部分癌细胞丝状伪足吞噬靶细胞使癌细胞的迁移能力增加导致肿瘤转移 ......
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