黄芪甲苷抑制高糖诱导的足细胞凋亡作用及机制(2)
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参见附件。
1.4细胞凋亡检测 ① 流式细胞仪检测足细胞凋亡率:上述已分化足细胞经同步化处理后,根据不同实验分组处理细胞,然后用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次,细胞刀刮下重悬于1×结合缓冲液中,调整待测细胞浓度为1×106个/mL,取100μL细胞悬液加入反应管中,然后分别加入5μL AnnexinV-FITC和5μL碘化丙啶(PI),轻轻混匀,避光室温反应15min,加入400μL 1×结合缓冲液,筛网过滤后用流式细胞仪检测,计算凋亡率。
② Hoechst-33342染色检足细胞凋亡率:上述不同实验组细胞以甲醇、冰乙酸混合液(体积比为3∶1)固定10min,用PBS冲洗两次,加入终浓度为5μg/mL的Hoechst-33342,避光室温孵育30 min,30%缓冲甘油封片。然后在激光扫描共聚焦显微镜下观察,各组随机选取不重叠10个视野计数细胞总数和凋亡细胞,计数200个细胞,计算凋亡细胞占总细胞数的百分比(凋亡率),重复实验3次。
1.5足细胞ROS检测用ROS特异性荧光探针CM-H2-DCF-DA标记细胞ROS水平, 将上述各实验组细胞放入含10μmol/L CM-H2-DCF-DA的PBS中37℃孵化45 min,然后用PBS冲洗并收集细胞,用激光扫描共聚焦显微镜检测ROS水平。
1.6Western印迹分析足细胞p38-MAPK活性 收集上述各实验组细胞以冷PBS洗涤两次后分别裂解细胞,4℃ 15 000r/min离心10 min后留取裂解液上清,用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。以12 %SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离,电泳完毕后将凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。室温下以5%脱脂奶粉封闭, 用抗磷酸化p38MAPK抗体4℃孵育过夜, 然后再与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h, DAB显色。用ECL化学发光剂处理, 胶片曝光, 扫描并定量分析胶片条带的光密度, 重复3次独立实验。
1.7统计学方法计量数据采用±s表示,组间比较采用单因素方差分析,用SPSS 11.0 统计软件分析。P<0.05认为有统计学差异。
2结 果
2.1 黄芪甲苷(AS-IV)对高糖诱导的足细胞凋亡的影响
流式细胞仪检测到高糖(HG)刺激24h后足细胞凋亡显著增加(P<0.05),与正常糖对照组(NG)相比, 差异有统计学意义(P<0.05),高渗对照组(MA)足细胞凋亡无明显增加(P>0.05),而AS-IV能呈剂量依赖性抑制高糖诱导的足细胞凋亡, 10、50、100μg/mL AS-IV干预24h后,足细胞凋亡率分别下降25%、40%、50%,差异均有统计学意义(P<0.05)见图1A。同样,Hochest33342染色后荧光显微镜下检测,高糖刺激24h可见明显足细胞凋亡(P<0.05),MA组足细胞凋亡无显著增加(P<0.05),AS-IV能显著抑制高糖诱导的足细胞凋亡,且呈剂量依赖关系,在100μg/mL作用最明显见图1B。
注:NG:正常糖对照组; MA:高渗对照组; HG:高糖刺激组
与NG组相比,*P<0.05; 与HG组相比, #P<0.05。
图1 流式细胞仪(A)及Hoechst-33342染色(B)检测
不同剂量黄芪甲苷(AS-IV)对足细胞凋亡的影响
2.2AS-IV对足细胞ROS水平的影响 与NG组相比,HG组足细胞内ROS水平显著增加(P<0.05),MA组足细胞内ROS水平无显著改变(P>005), 而AS-IV能呈剂量依赖性减少足细胞ROS水平,在10μg/mL剂量时发挥作用,在100μg/mL剂量时达高峰(P<0.05)见图2。
注:NG:正常糖对照组; MA:高渗对照组; HG:高糖刺激组。
与NG组相比,*P<0.05 ; 与HG组相比, #P<0.05。
图2 不同剂量黄芪甲苷(AS-IV)对足细胞ROS水平的影响
2.3AS-IV对足细胞p38-MAPK活性的影响 与NG组相比,HG刺激显著激活p38-MAPK信号通路(P<0.05),MA对p38-MAPK通路活化无明显作用(P>0.05)。而AS-IV能显著抑制高糖诱导的足细胞p38-MAPK活化,其作用呈明显剂量依赖关系,在100μg/mL剂量时作用最显著(P<0.05)见图3。
注:NG:正常糖对照组; MA:高渗对照组; HG:高糖刺激组。
图3 不同剂量黄芪甲苷(AS-IV)对足细胞
p38-MAPK活化的影响
3讨论
DN属中医“消渴”、“水肿”、“尿浊”、“虚劳”等范畴。病位在肝、脾、肾, 基本病机为气阴两虚,并兼夹瘀血、水湿、痰浊等标证。本虚标实、虚实夹杂的病机特点和复杂的病机演化规律决定了DN中医证型的多样化。研究报道[4]认为DN是在“消渴”气阴两虚的基础上发展起来的,气阴虚损、血瘀阻络贯穿本病始终。黄芪有补气升阳,固表止汗,利尿消肿等功效,一直作为治疗DN的常用药物在临床中广泛使用,黄芪甲苷(AS-IV)是黄芪的有效药理成分之一,本研究首次发现AS-IV能明显抑制高糖所致的足细胞凋亡,将为防治早期DN开辟一条新途径。
大量研究表明DN早期就可出现足细胞凋亡,继而加重疾病进展,最近动物实验证实1型及2型DN足细胞凋亡均显著增加[5],且足细胞凋亡比足细胞脱落剥离、微量白蛋白尿及细胞外基质增生发生更早,提示足细胞凋亡是早期DN进展的新机制[1]。笔者采用流式细胞仪及Hoechst染色检测细胞凋亡,均发现黄芪甲苷(AS-IV)能呈剂量依赖性抑制高糖诱导的足细胞凋亡,其中100μg/mL抑制作用最明显,提示AS-IV对高糖诱导的足细胞凋亡具有明确的抑制作用。
氧化应激是引起早期DN进展的重要机制,早期DN产生的氧化应激以形成活性氧(ROS)为特征,现已证实ROS是引起足细胞凋亡的重要因素[1],高糖能直接促进足细胞ROS的产生[6],并通过p38-MAPK信号通路诱导足细胞凋亡[1]。AS-IV具有广泛的药理作用,抗氧化是AS-IV的重要研究领域之一,体内和体外实验均已证实AS-IV有明确抗氧化作用,从而减轻心肌缺血损伤[7] ......
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