胰泰复方对慢性胰腺炎所致纤维化大鼠血清MDA含量血小板源性生长因子PDGF-B表达的影响(2)
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参见附件。
1.3 标本采取
1.3.1 提取血清
先将大鼠倒持压迫眼球,使其突出充血后,用止血钳迅速取出眼球,眼球内很快流出血液,用事先准备好的试管接取血液(2mL),经离心机38004/min离心10min,制备血清,用于生化指标的测试。
1.3.2 胰腺取材 实验动物处死后开腹取材,摘取大鼠胰腺组织后立即投入4%多聚甲醛溶液中固定12h后,梯度酒精(A)脱水(80%A～95%A×2～100%A×3),二甲苯透明,石蜡包埋。切片厚度5μm,裱于干净载玻片上置60°恒温箱中烤片12h。使用PDGF-B试剂盒,按说明书操作,进行组织化学染色。
1.4 血清MDA测定
用南京建成生物工程研究所提供的MDA测试盒,按说明书进行操作。酶标仪波长调至492nm,测各管吸光值(OD值)。以标准品144、72、36、18、9、4.5、2.25、0ng/mL之OD值在半对数纸上作图,画出标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相应MDA含量。
1.5 PDGF-B表达测定
使用病理图像分析系统对PDGF-B免疫组化染色结果进行分析,每组随机选10个视野,用显微镜将组织放大200倍后经显微镜摄像仪摄入,按512×512像素分布将图像摄入并保存在病理图像分析系统内,选用免疫组织化学分析模块对切片进行分析。先将图像进行分割,选择点状分割根据阳性表达标记灰度,分析阳性目标面积占统计场面积的百分比。
1.6 统计学处理
应用SPSS 13.0统计软件,计量资料以(±s)表示,采用LSD-t检验。
2结果
2.1 血清MDA含量测试结果
见表1。
2.2 PDGF-B免疫组织化学染色结果
见表2。
模型组大鼠胰腺组织中PDGF-B含量显著高于空白组(P<0.01),中药治疗组PDGF-B含量低于中药对照组
表1 各组之间MDA含量的比较(±s)
组别n丙二醛(MDA)含量 (ng/mL)
空白组100.456±0.349*
模型组93.654±1.684
中药对照组82.077±0.546*
中药低剂量组91.652±0.229□*▲
中药高剂量组101.012±0.230△*
注:与中药对照组比较,□P<0.05;与中药对照组比较,△P<0.01;与模型组比较,*P<0.01;与中药高剂量组比较,▲P<005。
表2 免疫组化检测PDGF-B结果对照表(±s)
组别nPDGF-B阳性目标积分面密度
空白组100.021±0.015*
模型组100.161±0.415
中药对照组100.106±0.025*
中药低剂量组100.082±0.011△*
中药高剂量组100.055±0.017△▲*
注:与中药对照组比较,△P<0.05; *与模型组比较,P<001;与中药低剂量组比较,▲P<0.05。
(P<0.05),提示胰泰复方能降低胰腺组织中PDGF-B含量,能明显抑制胰腺纤维化进程,对胰腺纤维化有一定的治疗作用。
3 讨 论
机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基,后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA),引发脂质过氧化作用,并因此形成脂质过氧化物,如:醛基(丙二醛MDA)、酮基、羟基、氢过氧基或内过氧基,以及新的氧自由基等。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成化学剂,而且放大活性氧的作用。氧自由基不但通过生物膜中PUFA的过氧化引起细胞损伤,而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。MDA的测定通常与超氧化物歧化酶(SOD)的测定相互配合,SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力,而MDA含量的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。
测试MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度,间接地反映出细胞损伤的程度。因此,在胰腺纤维化时血清中MDA水平升高,这一测定结果对于慢性胰腺炎诊断和治疗方面均有着较高的应用价值。
血小板源性生长因子(PDGF)是首先从血小板中分离出的一种由多种细胞合成和分泌的主要促有丝分裂因子[1],系由两种肽链(A链或B链)组成的同型或异型二聚体。依不同的细胞来源,有3种形式:PDGF-AA、PDGF-AB和PDGF-BB[2]。PDGF-B编码基因位于第22号染色体,主要由内皮细胞和巨噬细胞产生。正常状态下,其蛋白表达处于很低的水平,在纤维化发生、发展中具有多种生物学效应,可以分泌到细胞外,作为间质和内皮细胞的趋化和生长因子,对细胞外基质的合成和分解起重要作用[3]。
目前国内外大量文献报道显示,某些细胞因子及细胞因子形成的复杂网络系统在胰腺纤维化的发生、发展过程中发挥重要作用。PDGF-B可能通过促使上皮细胞、成纤维细胞发生有丝分裂促进这些细胞的增殖和分化,同时还可能通过抑制胶原的降解来发挥其促纤维化的作用[4]。对于慢性胰腺炎胰腺纤维化发生、发展来说,胰腺星状细胞(PSC)的活化起关键作用。活化的PSC大量增殖,继而转化为成纤维样细胞并表达α-平滑肌肌动蛋白(α-sMA)。同时活化的PSC合成过多的细胞外基质沉积在组织中,最终导致胰腺纤维化的发生和发展[5]。而PDGF-B作为促进细胞有丝分裂最强烈的刺激因子,对PSC的活化、增殖、合成胶原及细胞外基质均有明显作用[6],使胰腺微血管周围激活的PSC具有缩血管效应,使胰腺微血管灌注不足,导致微血管缺血从而加重胰腺纤维化[7]。
本研究结果显示,慢性胰腺炎典型的病理表现主要是胰实质纤维化,PSC的活化及ECM的沉积是其主要病理基础。“胰泰复方”能降低MDA含量和抑制PDGF-B表达,其机制可能是该方中的有效成分通过抑制MDA含量、PDGF-B的表达,进而抑制成纤维细胞的增殖和活化,减少ECM沉积,减轻纤维化程度,延缓了胰腺纤维化的进展。由此可以看出,根据“健脾疏肝活血法”研制出的“胰泰复方”对慢性胰腺炎的治疗具有确切和较理想的疗效。
参考文献
[1] Marra F,GentilinA,pinzani M et al.Phosphatiolylinositol 3-kinase is required for platelet-derived growth factor’s on hepatic stellatecell[J] ......
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