红花注射液对急性肝损伤大鼠抗氧化作用的实验研究(2)
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参见附件。
1.2模型备制
清洁雄性健康SD大鼠,共80只,体重(200±20)g,在实验室分笼饲养一周,其中室温维持25℃,实验前12h禁食,自由饮水。
将SD大鼠随机分为4组:①模型组(n=24):LPS(50μg/kg)+D-GalN(300mg/kg),用1mL生理盐水溶解后腹腔内注射。②治疗组(红花治疗组)(n=24):于建模前半小时,尾静脉注射红花注射液2.5mL/kg。③阳性对照组(还原型谷胱甘肽组)(n=24):于建模前半小时,尾静脉注射还原型谷胱甘肽108mg/kg。④空白对照组(n=8):于相应建模时间点,腹腔内注射1mL生理盐水。各组动物分别于6h、24h和48h随机取8只动物,采用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,腹主动脉采血,离心将血清分装保存-20℃待检测,并取肝左叶小块肝组织,一部分以10%中性甲醛固定,石蜡包埋切片,苏木精-伊红(HE)染色,光镜下进行组织形态学观察,一部分4℃低温制备10%肝组织匀浆液测定SOD活性、MDA含量。
1.3观察指标
光镜下进行肝组织形态学观察;使用自动生化分析仪测定各实验组血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平;通过硝酸还原酶法测定血清NO水平;肝组织匀浆液严格按照试剂盒说明,分别用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性、硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间差异比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验。
2结 果
2.1 肝组织大体形态学的改变
肉眼观察,空白对照组肝脏形态正常,被膜光整、色泽红润、质地柔软;模型组24h和48h之肝脏则明显肿胀、失去正常红润光泽而略显苍白、表面见散在的点状及片状出血点、质地偏韧;治疗组和阳性对照组各时间点则接近空白对照组。
2.2肝组织病理学观察结果
光镜(×200)观察结果,HE染色显示,空白对照组:大鼠肝组织光镜下结构完整、清晰,肝小叶结构正常,无中性粒细胞浸润,无肝细胞变性坏死现象,肝窦无增宽,汇管区及中央静脉无异常。模型组:大鼠肝组织6 h切片可见炎细胞浸润和碎片状坏死,炎症细胞浸润;24 h切片肝组织结构尚存,可见肝细胞肿胀、边界模糊,肝细胞有大片状坏死和多量炎症细胞浸润;48h切片肝组织小叶结构紊乱,可见肝细胞坏死更加明显,弥漫性炎细胞浸润。治疗组和阳性对照组:大鼠肝细胞坏死和炎细胞浸润减少,肝细胞水肿减轻,肝小叶结构接近正常肝组织。
2.3血清生化检测结果
模型组血清ALT、AST在6h开始增高,24h达峰值,48h时仍处于高水平,各时间点测定均显著高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01);治疗组及阳性对照组大鼠血清ALT、AST在6h处于较高水平,24h、48h则逐渐下降,虽高于空白对照组,但明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),而两组大鼠的血清ALT、AST水平无明显差异(P>0.05),见表1。
表1 各组大鼠血清生化指标检测结果(±s)
注:与空白对照组比较,aP<0.05,bP<0.01;与模型组6、24h和48h比较,cP<0.05,dP<0.01。
表2 各组大鼠抗氧化指标检测结果(±s)
注:与空白对照组比较,bP<0.01;与模型组6、24h和48h比较,dP<0.01。
2.4抗氧化指标血清NO水平 肝组织SOD活性和MDA含量的检测结果
模型组血清NO水平和肝组织MDA含量6h达到较高水平,24h达峰值,48h仍处于高水平,各时间点测定均显著高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01);治疗组及阳性对照组血清NO水平和肝组织MDA含量6h处于较高水平,但24h、48h逐渐下降,虽高于空白对照组,但明显低于模型组,差异有统计学意义(P<001)。模型组肝组织SOD活性6h达到较低水平,24h达谷值,48h仍处于低水平,各时间点测定均显著低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01);治疗组及阳性对照组肝组织SOD活性6h在较低水平,但24h、48h逐渐升高,虽低于空白对照组,但明显高于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。治疗组及阳性对照组血清NO水平、肝组织SOD活性和MDA含量各时间点相比较无明显差异(P>005),见表2。
3讨 论
内毒素性AHI是急诊科常见的病理过程,感染、休克、缺血再灌注胃肠衰竭、肝硬化、创伤和严重烧伤等重症患者引起内毒素血症均涉及到这一过程,其中有多种炎症因子参与并促进了AHI的病理发展,同时氧自由基和脂质过氧化反应也起着重要的作用。NO与超氧自由基反应生产过氧亚硝酸根离子,可以造成细胞膜脂质过氧化,阻断细胞内能量合成及DNA复制,影响线粒体功能,产生细胞毒作用[3]。SOD是重要的自由基清除物,其功能障碍将促使氧自由基水平升高及脂质过氧化反应增强,同时脂质过氧化产物MDA与膜磷脂、蛋白质分子等相结合,使细胞膜的基本结构破坏,蛋白质活性丧失,进而导致细胞死亡。这显示有效抑制氧自由基和脂质过氧化反应可以防治内毒素性AHI的发展。
红花是传统的中草药,为菊科红花属植物,性辛、温,归心、肝经。《本草汇言》载:“红花,破血行血和血调血之药也”,具有活血通经,祛瘀止痛的作用。红花注射液由红花提取精制而成,其主要有红花黄色素、红花醌苷、山奈酚、槲皮素、黄芪苷等成分。研究表明[4],红花具有抗氧化、抗凝、防止血栓形成、抗炎症因子、抗氧自由基和扩张血管作用,奚胜艳等[5]研究还发现红花具有抗肿瘤作用,但红花对内毒素性AHI的保护作用研究甚少。本实验显示,内毒素性AHI模型组大鼠血清NO水平明显升高,肝组织SOD活性明显减低,MDA水平明显升高,随着时间延长肝损伤逐渐加重,产生了一定量的氧自由基及脂质过氧化反应,进一步加剧肝损伤的病理改变。红花治疗组血清NO水平明显降低,肝组织SOD活性明显增强,MDA水平明显降低,肝酶水平降低和肝组织病理改变减轻,并且与阳性对照组变化无显著差异。表明红花注射液可通过提高机体抗氧化能力,降低体内氧自由基水平,减轻脂质过氧化反应,有效降低血清中ALT、AST水平,减轻肝组织的水肿坏死 ......
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