亚麻木酚素对糖尿病小鼠肾脏保护作用及机制(2)
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参见附件。
适应性喂养1星期后,禁食6h,按170mg/kg腹腔内一次性注射链脲佐菌素(STZ,Sigma公司)。STZ临用前用枸橼酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH4.5)配制,使用前过微孔滤膜除菌。同时设立正常对照组(NC组,n=12),注射等量的枸橼酸钠缓冲液。正常饮食,不使用胰岛素及其它降糖药物。72h后测血糖高于16.7mmol/L,则造模成功[3]。
1.2 动物分组及给药
造模成功后按血糖随机分为5组,每组12只。糖尿病对照组(DC组)、二甲双胍治疗组〔D+MEF组(100mg/kg,昆山双鹤药业有限公司,批号:0501231)〕、亚麻木酚素提取物治疗高、中、低剂量组〔D+HFLE组、D+MFLE组、D+LFLE组,由本试验室制备[4],开环异落叶松脂素(SECO)含量为301mg/g,剂量分别为0.6、1.2、3.6g/kg〕。各治疗组用药均在临用前用双蒸水配成混悬液,DC组及NC组则灌予等量双蒸水。灌胃体积均为0.1mL/10g体重。每组灌药1次/天,连续给药8周。
1.3 标本收集
各组小鼠喂养8周后,于代谢笼中收集24h尿液,于-30℃冰箱中保存待用于测定尿微量白蛋白。麻醉处死后取双肾,去除包膜,用冰冷的生理盐水洗去表面污物后称重,左肾用10%福尔马林溶液固定,待作病理检查。其余标本取0.2g左右组织用生理盐水制成5%的组织匀浆,3500r/min离心15min后取适量上清液备测。
1.4 观察指标及方法
1.4.1一般情况 包括精神状态、饮食、毛色、尿量及体重增长。
1.4.2 尿微量白蛋白排泄率采用胶体金双抗夹心法检测。
1.4.3 肾重(KW) 体重(BW) 肾脏脏器系数(KW/BW)体重由电子秤测量,肾重由天平测量。根据公式肾脏脏器系数=双侧肾重/体重×100%计算。
1.4.4 肾脏组织丙二醛(MDA) 超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,按照试剂盒说明书取肾脏组织匀浆测定,肾脏组织蛋白定量用考马斯亮兰法。
1.4.5 肾脏组织病理学检查 肾脏组织经10%的福尔马林固定约4h后,经过PBS缓冲液漂洗、逐级酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡与包埋、切片和苏木素-伊红染色(HE染色)后,进行光镜下病理观察分析。
1.5 统计方法
采用SPSS 12.0统计软件对数据进行分析。数据以±s表示,均数间比较采用方差分析,两两比较时,方差齐性时用LSD检验。方差不齐时用Dunnett T3检验。配对资料采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结 果
2.1 FLE对糖尿病小鼠一般状况影响
NC组小鼠体重明显增加,精神状态良好,动作敏捷,毛色光泽,饮食与饮水正常,粪便正常。模型小鼠在腹腔组注射STZ 72h后饮食及饮水量较正常鼠明显增加,而且精神萎缩,反应迟钝,活动度差,毛色差,尿量增多。治疗期间,DC组小鼠持续多饮、多食、多尿,精神倦怠,动作迟缓。各治疗组亦出现类似情况,但情况较轻。
2.2 FLE对糖尿病小鼠体重及血糖水平的影响
造模后及给药8周后,糖尿病各组体重均比同期正常组减轻。造模后,糖尿病各组间体重无差异性;给药8周后,FLE各剂量组体重与模型对照组间无差异,但二甲双胍治疗组体重较模型对照组有显著差异性(P=0.023),可见FLE对小鼠体重无明显影响。
造模后及给药8周后,各治疗组血糖均比同时期正常对照组高(P<0.05);造模后,各治疗组间血糖比较无差异性(P>0.05);8周后,模型对照组及FLE各剂量组血糖继续升高,与治疗前比较无差异性(P>0.05),但二甲双胍治疗组较试验前显著降低(P<0.05),见表1。
表1 FLE对糖尿病小鼠血糖及体重的影响
组别n造模后血糖(mmol/L)第50天血糖(mmol/L)造模后体重(g)第50天体重(g)
NC126.8±0.46.7±0.528.9±1.841.6±2.6
DC1222.6±2.2#24.5±2.323.8±3.430.9±4.3
D+LFLE1221.8±3.0#23.5±2.123.6±2.529.6±3.9
D+MFLE1222.5±2.3#24.2±2.223.6±2.330.4±3.9
D+HFLE1221.9±3.4#23.9±2.423.8±1.929.9±3.8
D+MET1221.5±2.6#16.3±2.2﹡23.0±1.227.7±2.3#
注:与造模后血糖比较,*P<0.05;与正常对照组(NC组)比较,#P<0.05。
2.3FLE对糖尿病小鼠肾脏重量 肾脏脏器系数及尿微量白蛋白排泄率的影响
解剖小鼠取出双侧肾脏,放在滤纸上吸附,称重并计算肾脏脏器系数,结果见表2。糖尿病各组肾脏脏器指数均明显高于正常对照组,各治疗组肾脏重量均明显低于模型对照组 (P<0.05);FLE中、高剂量组肾脏脏器系数明显低于模型对照组和二甲双胍治疗组(P<0.05),中、高剂量组肾脏系数平均下降11.1%和16.7%。糖尿病各组小鼠尿微量白蛋白排泄率均较正常对照组小鼠有明显升高(P<0.05)。FLE中、高剂量组小鼠的尿微量白蛋白排泄率低于模型对照组,差异均有显著性(P<0.05),FLE低剂量组及二甲双胍治疗组小鼠尿微量白蛋白排泄率较模型对照组有所降低,但差异无显著性(P>0.05)。
表2 FLE对糖尿病小鼠肾脏重量
肾脏脏器系数及尿微量白蛋白排泄率的影响(±s)
组别n肾脏重量(g)肾脏脏器系数(%)尿微量白蛋白排泄率(μg/min) ......
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