肾病Ⅰ号方对大鼠系膜细胞增殖及CTGFCOL-Ⅳ表达的影响(2)
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参见附件。
1.2.4ELISA法测细胞上清液中COL-IV含量 采集以上各组培养上清液,离心后取上清液于-80℃冰箱保存。按ELISA试剂盒说明书的步骤进行操作,测定标准品及样品的吸光度(OD)值,然后以标准品浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘制标准曲线。根据样品OD值在标准曲线上计算出样品中FN蛋白的含量。
1.2.5 实时荧光定量PCR法检测CTGF mRNA表达 药物处理同上,抽提细胞总RNA,以AMV第一链cDNA合成试剂盒逆转录为cDNA。上下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。目的基因CTGF引物序列:上游引物:5'-TAG CAA GAG CTG GGT GTG TG -3';下游引物:5'- TTC ACT TGC CAC AAG CTG TC-3'。内参基因GAPDH引物序列:上游引物:5'- AGA CAG CCG CAT CTT CTT GT-3';下游引物:5'- CTT GCC GTG GGT AGA GTC AT-3'。CTGF基因扩增片段长度为156bp,GAPDH基因扩增片段长度为207 bp。参照试剂盒说明书,总反应体系为25μL,实时定量PCR反应在Cotbett Roto-Gene 3000实时定量PCR仪中进行。PCR程序: 95℃ 90s变性,然后 95℃ 5s,58℃ 30s重复 40个循环进行扩增;设定熔解曲线程序:95℃ 1min,58℃ 1min, 58℃ 10s,从 58℃缓慢升温95℃,每升高 0.5℃检测一次荧光信号值。反应结束仪器自动生成CT(threshold cycles)值及熔解曲线图(图1)。每个样本设 2个重复管。采用实时荧光定量PCR相对定量分析方法:2-△△Ct法进行分析。△△Ct = ( Ct目的基因-Ct管家基因 )实验组-( Ct目的基因 -Ct管家基因)对照组,本实验以正常组为对照组,其余各组 mRNA的相对表达量用对照组的 2 -△△ Ct倍表示。
图1 熔解曲线图
1.3统计学方法
采用SPSS 13.0 for Windows统计软件进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用多样本均数间两两比较的 LSD法,计量资料数据用±s表示。相关指标做线性相关分析。
2 结果与分析
2.1 肾病Ⅰ号方对大鼠系膜细胞增殖的影响
与正常对照组比较,肾病Ⅰ号方各剂量组和洛汀新组均能显著抑制系膜细胞的增殖(P<0.01或P<0.05),其中以肾病Ⅰ号方高剂量组48h的抑制率最高达到67.61%;肾病Ⅰ号方高剂量组与洛汀新组比较,对抑制系膜细胞增殖差异显著(P<0.05)。在同一时间点,随着肾病Ⅰ号方浓度增加,其抑制率增加;肾病Ⅰ号方浓度相同时,随时间增加,抑制率增加。这说明肾病Ⅰ号方对GMC增殖的抑制作用,具有一定的剂量和时间依赖效应,见表1。
2.2 肾病Ⅰ号方对大鼠系膜细胞分泌COL-IV的影响
由表2可见,肾病Ⅰ号方能抑制体外培养的大鼠系膜细胞合成和分泌COL-IV。与正常对照组比较,肾病Ⅰ号方各剂量组抑制大鼠系膜细胞分泌COL-IV具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。与洛汀新组比较,肾病Ⅰ号方各剂量组抑制细胞分泌COL-IV无明显差异(P>0.05)。与肾病Ⅰ号方低剂量组比较,肾病Ⅰ号方各剂量组间呈现出一定的浓度依赖和时间依赖的特点,见表 2。
表1 各组细胞增殖情况(±s)
组别nOD值
24h48h
抑制率(%)
24h48h
正常对照组60.6745±0.17922.3699±0.284--
SBYHF低剂量组60.5599±0.1184*1.6103±0.4195*16.9932.05
SBYHF中剂量组60.4171±0.1027*#0.8071±0.211*#38.1665.95
SBYHF高剂量组60.365±0.0785*#※0.7677±0.1949*#45.8967.61
洛汀新组60.4478±0.0633*#0.8989±0.1583*#33.6162.07
注:与正常对照组比较,*P<0.01;与SBYHF低剂量组比较,#P<0.01,◇P<0.05;与洛汀新组比较,※P<0.05。
表2 各组培养上清液中 COL-IV含量的
比较(±s)
组别nCOL-IV(ng/mL)
24h48h
正常对照组630.005±10.39446.789±7.646
SBYHF低剂量组626.860±6.89438.449±8.787▲
SBYHF中剂量组616.097±3.658*#28.179±6.608*#
SBYHF高剂量组614.528±4.041*#24.0875±4.598*#
洛汀新组618.439±2.959*◇28.306±5.306*# 注:与正常对照组比较,* P<0.01,▲P<0.05;与SBYHF低剂量组比较,#P<0.01,◇P<0.05。
2.3 肾病Ⅰ号方对大鼠系膜细胞CTGF mRNA表达的影响
由表3可见,实时荧光定量PCR结果分析显示:与正常对照组比较,肾病Ⅰ号方各剂量组与洛汀新组作用大鼠系膜细胞24h后,均能下调CTGF mRNA的表达,其中以肾病Ⅰ号方高剂量组降低最明显(P<0.01)。与洛汀新组比较,肾病Ⅰ号方中剂量组下调CTGF表达无明显差异(P>0.05),肾病Ⅰ号方高剂量组降低CTGF基因表达有显著差异(P<0.05)。且肾病Ⅰ号方各剂量组间呈现明显剂量依赖关系(P<0.01)。见表3。
表3 各组CTGF mRNA相对表达变化(±s)
组别n平均 △△Ct2- △△Ct
正常对照组6-1 ......
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