含溶栓颗粒血清对TNF-α损伤人脐静脉内皮细胞ICAM-1的影响研究(2)
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1.3 细胞培养及加含药血清
HUVEC用含有10%胎牛血清的DMEM培养液,置孵箱(37℃,5%CO2)培养。镜下细胞计数,待细胞达对数增长期,实验共分6组,接种于24孔培养板,接种密度3×104/mL,为空白组、模型组、正常血清组、大剂量中药组、中剂量中药组、小剂量中药组。分组后置37℃,5% CO2培养箱孵育,除空白组外各组加入TNF-α(40ng/mL)孵育6h,用含药血清处理24h后检测。空白组:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)+DMEM培养液;模型组:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)+DMEM培养液+ TNF-α孵育。正常血清组:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)+DMEM培养液+ TNF-α孵育+正常血清组血清。大剂量中药组:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)+DMEM培养液+ TNF-α孵育+大剂量中药组血清。中剂量中药组: 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)+DMEM培养液+ TNF-α孵育+中剂量中药组血清。小剂量中药组:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)+DMEM培养液+ TNF-α孵育+小剂量中药组血清。
1.4 培养细胞 CD54检测按照免疫组化试剂盒说明进行。培养细胞形态观察采用HE染色,光镜下观察。
1.5 统计学处理 应用PEMS 3.1统计软件进行分析。定量资料实验结果以±s表示,均数间差异采用方差分析和t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 形态学观察
模型组、正常血清组HUVEC细胞数量下降,皱缩、变形,分裂相细胞明显增加,细胞形态发生明显变化:血管内皮细胞部分呈明显的长梭形、星形,似成纤维细胞样改变,细胞间隙增大。大、中、小剂量中药组细胞密度大于模型组及正常血清组,分裂相细胞少于模型组及正常血清组。以下为每组各观察10个放大200倍光镜下视野所记录的有丝分裂细胞数。
表1 各组有丝分裂细胞数比较
组别n有丝分裂细胞数总细胞数分裂细胞千分比(‰)
空白组10424521.63
模型组1037252114.6
正常血清组10322403 13.3
大剂量组10828632.79
中剂量组101527325.49
小剂量组101924037.91
2.2 ICAM-1蛋白表达
空白组HUVEC细胞少量表达ICAM-1,模型组、正常血清组HUVEC细胞ICAM-1表达较多。大、中、小剂量中药组细胞ICAM-1表达较空白组多,较模型组和正常血清组少。各组10×40倍光镜下计数10个视野,计算阳性细胞数量。结果显示:模型组和正常血清组ICAM-1蛋白表达较空白组明显增多,而大、中、小剂量组ICAM-1蛋白表达较正常血清组明显减少,并有一定的量效关系。模型组与正常血清组ICAM-1蛋白表达相当。
表2 各组ICAM-1蛋白表达阳性细胞数量比较
组别n阳性细胞数总细胞数阳性细胞百分比(%)
空白组107835422.03
模型组1018629563.05
正常血清组1019531561.90
大剂量组108231725.86
中剂量组1010135128.77
小剂量组1012936835.05
3 讨 论
近年来研究表明,内皮细胞不仅是机械性防御结构,而且是体内最大的“内分泌器官”,内皮细胞还具有产生细胞因子的作用,可通过旁分泌或自分泌形式在其生成的微环境中直接发挥作用,或进入循环系统,引起全身效应[2];各细胞因子相互制约、相互调节,参与机体免疫和炎症反应,影响补体、血小板活化因子的生成,调节细胞黏附分子的表达。
本研究发现,溶栓颗粒对TNF-α损伤人脐静脉内皮细胞有保护作用,溶栓颗粒的这一作用可能由于减少细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达而实现。
正常情况下ICAM-1呈低表达,某些细胞因子刺激或在炎症部位表达增强。某些细胞因子及炎症介质是促进黏附分子上调的信号因子,如IL-1β在脑缺血时迅速表达,使ICAM-1上调[3]。细胞培养的研究结果表明,单纯缺氧不能刺激血管内皮细胞表达ICAM-1,而炎症介质IL-1β和TNF-α对其具有强烈的诱导作用[4]。TNF-α、IL-6,IL-8也在缺血中扮演了重要炎性介质的角色。
本研究参考相关文献[5],用40ng/ml TNF-α孵育HUVEC 6h,发现ICAM-1表达明显增加,而没有TNF-α损伤的HUVEC很少表达ICAM-1。说明TNF-α造成损伤的HUVEC表达ICAM-1明显增多,可能是动脉粥样硬化的机制之一。TNF-α损伤的HUVEC分裂相细胞增多,而既往未见报道ICAM-1增加细胞分裂,可能与细胞受损后自身修复增强有关,也可能有其他机制参与。前期研究发现溶栓颗粒有减少缺血再灌注大鼠TNF-α表达的作用,并减少ICAM-1表达。本研究应用外源性TNF-α损伤血管内皮细胞,用含溶栓颗粒大鼠血清进行干预时,仍减少了ICAM-1表达,说明溶栓颗粒减少ICAM-1表达的作用并不单纯从减少TNF-α表达的间接途径实现,可能也有直接减少ICAM-1表达的途径。而且含溶栓颗粒大鼠血清干预的HUVEC分裂相细胞数量液有所减少,说明溶栓颗粒还有减少受损HUVEC分裂增殖的作用。
Printseva等[6]第一次证明了人AS病变中内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞表达ICAM-1,其中脂纹病变表达量最大。正常人动脉内皮及斑块以外的内膜和平滑肌细胞不表达或仅轻微表达ICAM-1。他们认为,ICAM-1在内皮细胞表达涉及单核细胞和淋巴细胞向内皮的黏附及迁移。
一系列研究表明[7-9],白细胞与内皮细胞的黏附,是以炎性因子为主的多种机制激发的,ICAM-1是关键因素。溶栓颗粒,尤其是大剂量溶栓颗粒,可以直接干预ICAM-1这一白细胞与内皮细胞的黏附的关键因素,从而减缓动脉粥样硬化形成。另外,溶栓颗粒减少血管内皮细胞分裂增殖,对稳定动脉粥样斑块稳定性或许有积极作用。
参考文献
[1] 孔宪寿.细胞粘附分子[J].国外医学•分子生物学分册,1994,16(1):1-5.
[2] Downey GP,Waddell TK,Fukshima T.Sue-A-Quan A Current techniques in cell and molecular biology[J].Crit Care,1995,10(3):136-149.
[3] Yamasaki Y,Matsuura N,Shozuhara H,et al.Interleukin-1 as a pathogenetic mediator of ischemic brain damage in rats[J] ......
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