活血健脾补肾法对MSC移植在结肠炎大鼠肠道增殖分化的影响(2)
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参见附件。
1.2方法
1.2.1动物造模方法[2]大鼠造模前禁食不禁水48h,禁食24h后提起鼠尾将其悬空,使挣扎以排出大肠远端的大便,共2次,每次相隔6h以上,排空大便后以氯氨酮(100mg/kg)一次性腹腔注射麻醉大鼠,用外径为2mm的硅胶管插入大鼠肛内约8cm,经管内注入5% 2、4、6-TNBs水溶液0.4mL(100mg/kg)加入50%乙醇0.25mL,约10s灌注完毕。
1.2.2动物分组与给药 SPF级SD雌性大鼠,造模第二天后随机分为模型对照组、MSC移植组、活血组、健脾组、补肾组,每组20只。将大鼠鼠尾常规用碘伏消毒,再用酒精去碘,用1mL注射器将约含2×106个雄性SD大鼠MSC的悬浮液[3]约0.4mL经鼠尾静脉注射于MSC移植组、活血组、健脾组及补肾组各只大鼠体内。按照实验动物及人体表面积比例换算,活血组大鼠桃红四物汤剂量为12g/kg、健脾组大鼠参苓白术散剂量为30g/kg、补肾组大鼠金匮肾气丸药物剂量为16g/kg,其他各组大鼠给予生理盐水2mL/只,灌胃给药,均为每日1次,连续15日。
1.2.3标本采集与处理 各组动物灌胃结束后,禁食不禁水24h后脱颈椎法处死动物,迅速剖腹,剖取距肛门2～10cm处结肠共8cm,沿肠系膜缘剪开肠腔,用冰生理盐水冲洗肠内容物,冲洗干净后,用无菌滤纸迅速拭干,将结肠组织以4%多聚甲醛固定,常规石腊包埋、切片待检。
1.2.4大鼠结肠组织Musashi-1 TERT的检测 免疫组化SABC法,按试剂盒说明书进行操作,石蜡切片脱蜡,水洗;3%过氧化氢室温孵育10min;滴加一抗,室温孵育60min;滴加二抗,室温孵育10min;滴加DAB溶液,镜检;苏木素复染;梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
1.3统计学处理方法
所有数据经SPSS 13.0统计软件处理,各组资料用±s表示,采用非参数统计方法Wilcoxon秩和检验比较各组资料间的差异,P<0.05为差异有显著性。
2结 果
2.1判断标准
采用半定量积分法计算染色积分[4-5],即分别对每张切片的阳性细胞数及阳性细胞着色程度进行分级记分,结果以两项之和表示。阳性细胞率:每张切片检测5个视野(×400),所见的阳性细胞分为0～4级(共5级):0级为阴性,记0分;1级阳性细胞占1%～25%,记1分;2级阳性细胞占26%～50%,记2分;3级阳性细胞占51%～75%,记3分;4级阳性细胞占76%～100%,记4分。染色强度:显微镜下观察,仅细胞核着蓝色者为阴性,细胞浆或核膜上呈棕黄色为阳性;强度分0～3级(共4级):0级为阴性,记0分;1级为弱阳性染色,记1分;2级为阳性染色,记2分;3级为强阳性染色,记3分。
2.2 各组大鼠结肠组织Musashi-1 TERT染色积分值
见表1。
表1各组大鼠结肠组织Musashi-1
TERT染色积分值(±s)
组别nMusashi-1TERT
模型对照组200.49±0.310.38±0.27
MSC移植组201.53±0.511.12±0.62
活血组203.31±0.54*2.95±0.62*
健脾组202.29±0.742.21±0.83
补肾组202.13±0.491.89±0.57 注:与MSC移植组比较,*P<0.05。
实验结果表明MSC移植组及中药治疗各组大鼠结肠黏膜组织Musashi-1及TERT均有阳性表达,其中活血组与MSC移植组比较差异有显著性意义,活血法代表方药桃红四物汤对MSC在UC大鼠结肠的增殖分化有明显促进作用。
3讨 论
正常情况下,结肠黏膜上皮是机体更新和修复较快的组织,结肠黏膜的再生和修复依赖于结肠黏膜干细胞,结肠黏膜干细胞位于结肠隐窝的底部,数量极少,可分化为成熟的结肠黏膜细胞,维持结肠黏膜的生理更新[6]。UC最典型的病理特点是大量隐窝坏死,形成脓肿,而结肠黏膜干细胞位于隐窝基底部,隐窝坏死导致原本极少的结肠黏膜干细胞进一步减少,无法再生和分化成为足够的结肠黏膜上皮细胞以修复损伤的黏膜[7-8]。因此,需大幅提高循环中的干细胞数量,以便随血循环到达病变结肠,在结肠微环境中,受诱导进行增殖和转分化为结肠黏膜干细胞和结肠黏膜上皮细胞,增强机体对病损黏膜的修复能力,促进溃疡愈合,恢复其正常的生理功能。
随着对干细胞鉴别和分离的研究进展,已有结果表明[9]:Musashi-1及TERT可作为肠道干细胞的标记物。Musashi-1是一种进化保守的RNA结合蛋白,研究表明musashi-l也是肠道干细胞的选择性标记。Kayahara等描述了在小鼠小肠的musashi-l阳性细胞[10];Nishimura等[11]也描述了其在结肠细胞中的表达情况。研究发现放射损伤后小鼠肠道标本的musashi-1明显增加;应用免疫组织化学在新生的小鼠肠道、成熟的小鼠肠道和再生肠道的隐窝中均检测到它的表达,与预言的干细胞区域相一致。端粒酶逆转录酶 (telomerase reverse transcriptase,TERT )是人类端粒酶的主要组成部分,是端粒酶活性的重要限速因子[12]。端粒酶系统在细胞的增殖、生长和衰亡过程中发挥重要作用,正常人体细胞除了生殖细胞、淋巴细胞、肠道干细胞外,几乎检测不到端粒酶的活性或活性很低。
本实验表明:MSC移植于结肠炎大鼠后,随血循环到达结肠定植,中医活血、健脾、补肾法中药对其有一定的促进作用,其中活血法代表方药桃红四物汤较明显促进MSC在结肠炎大鼠肠道增殖分化;实验结果揭示了UC治疗的新思路。
参考文献
[1] 胡建昆,陈心足,周总光.干细胞与组织工程在肠道的研究进展[J].中国修复重建外科杂志,2007,21(2):175-179.
[2] 张涛,谢建群.大鼠溃疡性结肠炎模型的实验研究[J].中国中西医结合消化杂志,2006,14(4):240-242.
[3] 杨晋,李映红,张永锋,等.大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定[J].深圳中西医结合杂志,2008,18(6):337-339.
[4] Koga H,Sakisaka S,Ohishi M et al.Expression of in human hepatocellular carcinoma:relevance to tumor differentiation[J].Hepatology,1999,29:688-696 ......
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