消斑通脉合剂对血管平滑肌细胞增殖和P21waf1/cip1蛋白表达的影响(2)
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参见附件。
1.2.3 MTT法检测VSMC增殖 将细胞以10%FBS的DMEM调整细胞浓度为2×105/mL,接种于96孔板中,每孔200μL,待其生长至60%融合时,换用0.5%FBS的DMEM培养基中培养24h,同步细胞于G0/G1期。将细胞随机分为4组,空白组(10%空白组血清)、模型组(10%空白组血清+PDGF-BB10ng/mL)、高剂量组(10%高剂量含药血清+PDGF-BB10ng/mL)、低剂量组(10%低剂量含药血清+PDGF-BB10ng/mL)。继续培养24 h后,每孔加入MTT (5mg/mL) 20uL,孵育4h,吸弃培养液,然后加入二甲基亚砜( DMSO) 150μL/孔,放于水平摇床轻微震荡10min,使其完全溶解,用酶标仪在490nm波长处测定OD值,每组9个复孔,结果取均值。
1.2.4流式细胞仪检测VSMC周期 将细胞以10%FBSDMEM调整浓度为1×105/mL,接种于25cm2培养瓶中,生长至60%融合时,换含0.5%FBS的DMEM继续培养24h,同步细胞于G0/G1期,作用24h后,收集细胞,70%冷乙醇固定, 4℃过夜。离心去固定液,PBS洗涤2次,300目尼龙网过滤,调整细胞浓度为1×106/mL,加入RNA酶(50μg/mL)及PI(50μg/mL)溶液,避光4℃染色30min后,上机检测,每组5个复管。
1.2.5 Western法检测各组VSMCs中P21 waf1/cip1表达将细胞调整浓度为1×106/mL,接种于10cm培养皿中,生长至60%融合时,换含0.5%FBS的DMEM继续培养24h,同步细胞于G0/G1期,更换培养基,细胞分组用药与MTT相同,每组5个样本,培养24h后,收集细胞。首先RIPA缓冲液抽取细胞总蛋白,取SDS-PAGE进行电泳分离,然后转PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭,一抗经4℃过夜,二抗在室温下1h,标准ECL法底物发光显影。
2 统计学处理
应用SPSS 13.0统计软件。所有数据以±s表示,两组比较采用t检验,多组比较采用单因素方差分析,以P﹤0.05表示差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 消斑通脉合剂对VSMCs增殖的影响模型组VSMCs经PDGF-BB刺激后,OD值明显增高,与空白组比较有显著差异(P﹤0.01);高剂量、低剂量组在药物血清干预24h后,OD值明显降低,与模型组比较有显著差异(P﹤0.01);低剂量组与高剂量组比较亦有统计学差异(P﹤0.05)。各组OD值比较见表1。
表1 各组对VSMCs增殖的影响(±s)
组 别nOD值
空白组90.01±0.01△
模型组90.12±0.02
低剂量组90.05±0.02△﹟
高剂量组90.04±0.01△
注:与模型组比较,△P﹤0.01;与高剂量组比较,﹟P﹤0.05。
3.2消斑通脉合剂对VSMCs细胞周期分布的影响
流式细胞仪分析结果显示,模型组VSMCs经PDGF-BB刺激后,与空白组比较,G0/G1期比例明显减少,而S期、G2/M期比例显著增高(P﹤0.01);给予药物血清干预24h后,与模型组比较,高、低剂量组G0/G1期比例增高,S期比例明显降低(P﹤0.01);低剂量组G0/G1期、S期比例与高剂量组比较亦有明显差异(P﹤0.05)。见表2、图1。
表2 各组VSMCs细胞周期分布结果(±s)
组别nG0/G1SG2/M
空白组593.09±0.56△4.85±0.30△1.89±0.25△
模型组567.36±2.2723.44±1.279.20±1.41
低剂量组576.27±0.81△﹟15.30±1.80△﹟8.42±2.38﹟
高剂量组588.53±0.34△7.95±0.31△3.52±0.22△
注:与模型组比较,△P﹤0.01;与高剂量组比较,﹟P﹤0.05。
[BW(S(Z,1,2)MD2]
[WT5”FZ〗中华中医药学刊
空白组 模型组
低剂量 高剂量
图1 各组VSMCs细胞周期分布
3.3消斑通脉合剂对各组VSMCs中P21 waf1/cip1蛋白表达的影响
结果表明,模型组p21蛋白表达与空白组比较显著减少(P﹤0.01),药物血清干预24h后,随药物浓度增加p21蛋白的表达逐渐增强,与模型组比较有显著差异(P﹤0.01);高剂量组与低剂量组比较亦有显著差异(P﹤0.01)。见表3、图2。
表3 各组VSMCs中P21waf1/cip1蛋白表达结果(±s)
组 别n灰度值
空白组51.03±0.02△
模型组50.46±0.01
低剂量组50.64±0.01△﹟
高剂量组50.76±0.01△
注:与模型组比较,△P﹤0.01;与高剂量组比较,﹟P﹤0.01。
A空白组 B模型组 C低剂量 D高剂量
图2 各组VSMCs中P21waf1/cip1蛋白表达
4讨 论
研究发现,血管内皮损伤后,多种细胞释放的生长因子和细胞因子可以诱导VSMCs表型转化、增值,其中血小板源性生长因子(PDGF-BB)是刺激VSMCs增值的强效促丝裂剂[4],实验应用PDGF-BB诱导VSMCs,建立细胞增殖模型,给予消斑通脉合剂药物血清干预后,通过MTT的检测结果显示,高、低剂量组与模型组比较,药物血清明显抑制了体外培养的VSMCs增殖,呈剂量依赖性;为明确各组细胞的增殖状态,应用流式细胞仪观察了各组细胞的细胞周期分布情况,结果显示,低剂量组与高剂量组主要是降低S期、G2/M期比例,提高G0/G1期比例抑制VSMCs的增殖,低剂量组与高剂量组比较亦呈现出明显的剂量依赖性,与MTT结果一致,提示了消斑通脉合剂药物血清通过阻滞细胞周期进程,达到抑制VSMCs增殖。
为进一步探讨药物血清阻滞VSMCs细胞周期进程的作用机制,笔者应用Western印迹法观察了P21蛋白在各组中的表达变化。P21蛋白是近年来发现的细胞周期负性调节蛋白,属于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitor,CDI),参与细胞生物学中的多种功能活动,在体内可以抑制细胞周期素(cyclin)、细胞周期蛋白激酶(CDK)及cyclin-CDK复合物,进一步影响Rb蛋白磷酸化,可以阻止转录因子E2F释放,使细胞周期停滞于G1期[5];Yang等[6]利用腺病毒介导在体外将P21基因转染到经过处理的VSMCs上,发现其有效地抑制90%以上VSMCs的增殖,并且发现细胞停滞在G0/G1期 ......
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