复明片对兔视网膜脱离后视网膜组织中(2)
参见附件(12kb)。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 动物及分组 成年健康有色家兔36只，体重2.0～2.5kg，雌雄各半，由湖南中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号：医动字第20-003号。随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、西药对照组(C组)、复明片组(D组)，每组9只。
1.1.2 药品 复明片：由黄芪、生地、茯苓、车前仁、地龙等益气养阴活血利水中药按现代制剂制备工艺制成，0.3g/片，选用同一批号药物，批号：040208。由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。使用时去掉糖衣，研成粉末，温开水混合，配制成浓度为10%的混悬液。
三磷酸腺苷二钠片(Adenosine Disodium Triphosphate Tablets, ATP)：20mg/片，福建古田药业有限公司生产，批号：050827-1；维生素B1(Vitamin B1, VitB1)：10mg/片，湖北华中药业有限公司生产，批号：20050801；维脑路通：60mg/片，山西晋新药业集团有限公司生产，批号：050811。使用时研成粉末，温开水混合，配制成每升水含VitB1276mg、ATP1102mg、维脑路通734mg的溶液。
透明质酸酶：上海第一生化药研所生产，批号：20050901。
1.1.3 主要试剂 MMP-2测试盒:武汉博士德生物工程有限公司生产；DAB显色试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司生产；S-P免疫组化染色超敏试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司生产。
1.2 方法
1.2.1 兔眼视网膜脱离模型建立 依照彭清华等提出的方法[2]，并加以改进。术前3天用0.25%氯霉素眼药水和1%阿托品眼药水交替滴眼，3次/日，手术当日生理盐水冲洗结膜囊，术前滴1%丁卡因眼药水2～3次。造模时术眼(均取右眼)采用10%新福林和1%阿托品散瞳。3%戊巴比妥耳缘静脉注射(1mL/kg)麻醉后，将兔固定于手术台上，庆大霉素+生理盐水混合液冲洗结膜囊，常规消毒铺巾、开睑。点丁卡因表面麻醉，下方筋膜下注入2%利多卡因0.2mL形成泡状隆起，沿角膜缘环行剪开鼻侧球结膜和筋膜，向后稍分离，暴露赤道部巩膜，距角巩缘后5mm睫状体平坦部用25GB-D针头垂直眼球壁刺穿巩膜，在眼底接触镜和显微镜直视下观察到伸入玻璃体内的针尖，将10IU/mL透明质酸酶溶液0.1mL缓慢注入到玻璃体的中央偏后部，拔针后压迫注射点3min。15min后再由原穿刺口将自制视网膜下腔注射针头缓慢探进，反复抽吸0.1mL液化的玻璃体，在眼底接触镜和显微镜直视观察下小心地把针尖引向后极部， 避开视网膜血管，在颞侧距视乳头1个视盘直径(Papilla Disc, PD)放射状视网膜处刺穿视网膜，进入视网膜下腔，助手缓慢推动注射器，注入液化的玻璃体液0.1mL，可见视网膜被分离，脱离的视网膜呈大片灰白色隆起，范围约1/2个PD大小，退出针头，角膜缘处放出房水以降低眼内压。术后铺平球结膜，结膜囊涂0.5%四环素眼膏，结膜下注射庆大霉素加地塞米松0.1mL，肌肉注射庆大霉素0.8万U，以防感染，术后1周每天4次氯霉素眼药水点眼，并一直给1%阿托品眼液散瞳。
1.2.2 给药方法 造模后第1天下午开始给药，A组(正常对照组)与B组(模型对照组)均予温开水灌胃，5mL/kg体重，1次/天；C组(西药对照组)予西药混合溶液灌胃，5mL/kg体重，1次/天；D组(复明片治疗组)予复明片混悬液灌胃，5mL/kg体重，1次/天。
1.3 观察指标及检测方法
实验开始后于造模后的第7天，14天，21天，依实验安排相应各小组取对应兔3只眼，用3%戊巴比妥耳缘静脉注射(1mL/kg)麻醉兔，摘除眼球，生理盐水冲洗干净。在冰生理盐水中，沿角巩缘剪开眼球达360°，弃角膜、晶体、玻璃体，保留视网膜连同脉络膜巩膜组织。取相应各小组取对应兔3只眼，将已经4%多聚甲醛固定12h的眼球壁修片，切取脱离部位视网膜(正常对照组切取相应部位)，再置于新的4%多聚甲醛固定液继续固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，一组切片经常规HE染色，另三组切片采用S-P免疫组化法检测视网膜组织中基质金属蛋白酶-2(matrix metallo- proteinase-2, MMP-2)的表达，DAB显色，苏木素复染，阴性对照则省去滴加MMP-2一抗的步骤。封片后镜检，显微摄影。
2 结果与分析
2.1 术后第7天MMP-2表达
正常对照组:视网膜组织切片MMP-2呈阴性表达(图1)。模型对照组:MMP-2在RPE细胞及巨噬细胞中阳性表达，着染深，阳性部位面积大(图2)。西药对照组:MMP-2在RPE细胞及巨噬细胞中阳性表达，着染深，阳性部位面积较模型对照组局限(图3)。复明片治疗组:MMP-2在RPE细胞及巨噬细胞中阳性表达，着染较对照组浅，阳性部位面积较对照组局限(图4)。
2.2 术后第14天MMP-2表达
正常对照组：视网膜组织切片MMP-2呈阴性表达 ......
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 动物及分组 成年健康有色家兔36只，体重2.0～2.5kg，雌雄各半，由湖南中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号：医动字第20-003号。随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、西药对照组(C组)、复明片组(D组)，每组9只。
1.1.2 药品 复明片：由黄芪、生地、茯苓、车前仁、地龙等益气养阴活血利水中药按现代制剂制备工艺制成，0.3g/片，选用同一批号药物，批号：040208。由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。使用时去掉糖衣，研成粉末，温开水混合，配制成浓度为10%的混悬液。
三磷酸腺苷二钠片(Adenosine Disodium Triphosphate Tablets, ATP)：20mg/片，福建古田药业有限公司生产，批号：050827-1；维生素B1(Vitamin B1, VitB1)：10mg/片，湖北华中药业有限公司生产，批号：20050801；维脑路通：60mg/片，山西晋新药业集团有限公司生产，批号：050811。使用时研成粉末，温开水混合，配制成每升水含VitB1276mg、ATP1102mg、维脑路通734mg的溶液。
透明质酸酶：上海第一生化药研所生产，批号：20050901。
1.1.3 主要试剂 MMP-2测试盒:武汉博士德生物工程有限公司生产；DAB显色试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司生产；S-P免疫组化染色超敏试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司生产。
1.2 方法
1.2.1 兔眼视网膜脱离模型建立 依照彭清华等提出的方法[2]，并加以改进。术前3天用0.25%氯霉素眼药水和1%阿托品眼药水交替滴眼，3次/日，手术当日生理盐水冲洗结膜囊，术前滴1%丁卡因眼药水2～3次。造模时术眼(均取右眼)采用10%新福林和1%阿托品散瞳。3%戊巴比妥耳缘静脉注射(1mL/kg)麻醉后，将兔固定于手术台上，庆大霉素+生理盐水混合液冲洗结膜囊，常规消毒铺巾、开睑。点丁卡因表面麻醉，下方筋膜下注入2%利多卡因0.2mL形成泡状隆起，沿角膜缘环行剪开鼻侧球结膜和筋膜，向后稍分离，暴露赤道部巩膜，距角巩缘后5mm睫状体平坦部用25GB-D针头垂直眼球壁刺穿巩膜，在眼底接触镜和显微镜直视下观察到伸入玻璃体内的针尖，将10IU/mL透明质酸酶溶液0.1mL缓慢注入到玻璃体的中央偏后部，拔针后压迫注射点3min。15min后再由原穿刺口将自制视网膜下腔注射针头缓慢探进，反复抽吸0.1mL液化的玻璃体，在眼底接触镜和显微镜直视观察下小心地把针尖引向后极部， 避开视网膜血管，在颞侧距视乳头1个视盘直径(Papilla Disc, PD)放射状视网膜处刺穿视网膜，进入视网膜下腔，助手缓慢推动注射器，注入液化的玻璃体液0.1mL，可见视网膜被分离，脱离的视网膜呈大片灰白色隆起，范围约1/2个PD大小，退出针头，角膜缘处放出房水以降低眼内压。术后铺平球结膜，结膜囊涂0.5%四环素眼膏，结膜下注射庆大霉素加地塞米松0.1mL，肌肉注射庆大霉素0.8万U，以防感染，术后1周每天4次氯霉素眼药水点眼，并一直给1%阿托品眼液散瞳。
1.2.2 给药方法 造模后第1天下午开始给药，A组(正常对照组)与B组(模型对照组)均予温开水灌胃，5mL/kg体重，1次/天；C组(西药对照组)予西药混合溶液灌胃，5mL/kg体重，1次/天；D组(复明片治疗组)予复明片混悬液灌胃，5mL/kg体重，1次/天。
1.3 观察指标及检测方法
实验开始后于造模后的第7天，14天，21天，依实验安排相应各小组取对应兔3只眼，用3%戊巴比妥耳缘静脉注射(1mL/kg)麻醉兔，摘除眼球，生理盐水冲洗干净。在冰生理盐水中，沿角巩缘剪开眼球达360°，弃角膜、晶体、玻璃体，保留视网膜连同脉络膜巩膜组织。取相应各小组取对应兔3只眼，将已经4%多聚甲醛固定12h的眼球壁修片，切取脱离部位视网膜(正常对照组切取相应部位)，再置于新的4%多聚甲醛固定液继续固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，一组切片经常规HE染色，另三组切片采用S-P免疫组化法检测视网膜组织中基质金属蛋白酶-2(matrix metallo- proteinase-2, MMP-2)的表达，DAB显色，苏木素复染，阴性对照则省去滴加MMP-2一抗的步骤。封片后镜检，显微摄影。
2 结果与分析
2.1 术后第7天MMP-2表达
正常对照组:视网膜组织切片MMP-2呈阴性表达(图1)。模型对照组:MMP-2在RPE细胞及巨噬细胞中阳性表达，着染深，阳性部位面积大(图2)。西药对照组:MMP-2在RPE细胞及巨噬细胞中阳性表达，着染深，阳性部位面积较模型对照组局限(图3)。复明片治疗组:MMP-2在RPE细胞及巨噬细胞中阳性表达，着染较对照组浅，阳性部位面积较对照组局限(图4)。
2.2 术后第14天MMP-2表达
正常对照组：视网膜组织切片MMP-2呈阴性表达 ......
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