益气化瘀方对大鼠前列腺增生组织MMP-2/TIMP-2表达的影响/(2)
参见附件(12kb)。
1.3 试剂及仪器
兔抗人MMP-2多克隆抗体(克隆号ZA-0331)，兔抗人TIMP-2多克隆抗体(克隆号：BRA-0283)，即用型鼠抗人CD34单克隆抗体试剂盒(克隆号：QBEnd/10)，PBS、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司；光学显微镜(OLYMPUS-CHC，日本)，石蜡切片机(SLEE-CUT-4060，德国)，全自动真色彩图像分析系统(LEICA Q 550IW PMLB，德国)。
2 实验方法
2.1 分组与造模
动物购入后适应性饲养1周，经观察无异常后编号称重，按体重层次随机分为正常组，模型组，非那雄胺组和益气化瘀方低、中、高剂量组，每组10只。除正常组外，其余各组参照《西药新药临床前研究指导原则汇编》[3]进行造模。戊巴比妥钠40 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，无菌条件下经阴囊摘除双侧睾丸，结扎残端以确保止血，缝合皮肤，肌肉注射青霉素20万U/只，恢复1周。从去势后第8天起，每只大鼠腹部皮下注射丙酸睾酮5mg·kg-1·d-1，1天1次，连续30天。
2.2 给药
从去势后第8天起，正常组和模型组按1mL/200g体重灌胃(ig)方式喂饲生理盐水；非那雄胺组按1mL/200g体重给予非那雄胺混悬液灌胃；益气化瘀方低、中、高剂量组按1mL/200g体重分别给予低、中、高浓度益气化瘀方混悬液灌胃，各组给药均1天1次，连续30天。各组大鼠在实验期间按组分笼饲养，自由进食、饮水，每周称体重1次，以调整给药用量。分别于给药后第31天处死大鼠，摘取前列腺组织待检测。
2.3 标本采集
各组连续ig给药后第31天，称体重，股动脉放血处死大鼠，完整摘取前列腺，去除被膜后用电子天平称湿重，测定大鼠前列腺体积，计算各组前列腺指数。取相同部位腺体组织用10%中性福尔马林固定，48h内石蜡包埋，连续切片，切片厚5μm，常规HE染色，光学显微镜下观察各组前列腺组织病理学形态。免疫组化SP法检测MMP-2、TIMP-2的表达。
2.4 检测指标及方法
2.4.1 前列腺指数(PI) 称取大鼠体重和前列腺湿重，计算前列腺指数。计算公式：PI前列腺质量(mg)/大鼠质量(g)×100%。
2.4.2 前列腺组织微血管密度(microvessel density，MVD) 微血管密度即单位面积的微血管数目，为表示组织血管生成状态的重要指标。微血管计数参照Maeda[4]等报道的方法。
2.4.3 前列腺组织MMP-2、TIMP-2表达 采用免疫组化SP法，MMP-2和TIMP-2工作浓度为1∶100，抗CD【sub】34【/sub】单克隆抗体工作浓度为1∶50，以PBS液(0.01mol/L，pH7.4)代替一抗作为阴性对照。DAB显色，苏木素复染，封片观察，按试剂盒说明操作。结果判定：以镜下细胞浆和细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞。采用全自动真色彩图像分析系统进行观察并半定量检测阳性物质的积分吸光度(IA)值(被测个体截面或投影轮廓或体积内IA值,即吸光物质的总含量，是阳性细胞着色面积及着色深度的综合体现)表示其含量，每张切片随机选择10个视野(×400)。
2.5 统计学方法
计量资料用(±s)表示，应用SPSS 12.0统计软件包进行单因素方差分析。
3 实验结果
3.1 前列腺指数、前列腺组织MVD
模型组、非那雄胺组、益气化瘀方各剂量组大鼠前列腺指数、前列腺组织MVD计数明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；益气化瘀方各剂量组和非那雄胺组大鼠前列腺指数、前列腺组织MVD计数明显低于模型组(P<0.05或P<0.01)；益气化瘀方中、高剂量组大鼠前列腺指数与非那雄胺组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，前列腺组织MVD计数明显低于非那雄胺组(P<0.05) ......
1.3 试剂及仪器
兔抗人MMP-2多克隆抗体(克隆号ZA-0331)，兔抗人TIMP-2多克隆抗体(克隆号：BRA-0283)，即用型鼠抗人CD34单克隆抗体试剂盒(克隆号：QBEnd/10)，PBS、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司；光学显微镜(OLYMPUS-CHC，日本)，石蜡切片机(SLEE-CUT-4060，德国)，全自动真色彩图像分析系统(LEICA Q 550IW PMLB，德国)。
2 实验方法
2.1 分组与造模
动物购入后适应性饲养1周，经观察无异常后编号称重，按体重层次随机分为正常组，模型组，非那雄胺组和益气化瘀方低、中、高剂量组，每组10只。除正常组外，其余各组参照《西药新药临床前研究指导原则汇编》[3]进行造模。戊巴比妥钠40 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，无菌条件下经阴囊摘除双侧睾丸，结扎残端以确保止血，缝合皮肤，肌肉注射青霉素20万U/只，恢复1周。从去势后第8天起，每只大鼠腹部皮下注射丙酸睾酮5mg·kg-1·d-1，1天1次，连续30天。
2.2 给药
从去势后第8天起，正常组和模型组按1mL/200g体重灌胃(ig)方式喂饲生理盐水；非那雄胺组按1mL/200g体重给予非那雄胺混悬液灌胃；益气化瘀方低、中、高剂量组按1mL/200g体重分别给予低、中、高浓度益气化瘀方混悬液灌胃，各组给药均1天1次，连续30天。各组大鼠在实验期间按组分笼饲养，自由进食、饮水，每周称体重1次，以调整给药用量。分别于给药后第31天处死大鼠，摘取前列腺组织待检测。
2.3 标本采集
各组连续ig给药后第31天，称体重，股动脉放血处死大鼠，完整摘取前列腺，去除被膜后用电子天平称湿重，测定大鼠前列腺体积，计算各组前列腺指数。取相同部位腺体组织用10%中性福尔马林固定，48h内石蜡包埋，连续切片，切片厚5μm，常规HE染色，光学显微镜下观察各组前列腺组织病理学形态。免疫组化SP法检测MMP-2、TIMP-2的表达。
2.4 检测指标及方法
2.4.1 前列腺指数(PI) 称取大鼠体重和前列腺湿重，计算前列腺指数。计算公式：PI前列腺质量(mg)/大鼠质量(g)×100%。
2.4.2 前列腺组织微血管密度(microvessel density，MVD) 微血管密度即单位面积的微血管数目，为表示组织血管生成状态的重要指标。微血管计数参照Maeda[4]等报道的方法。
2.4.3 前列腺组织MMP-2、TIMP-2表达 采用免疫组化SP法，MMP-2和TIMP-2工作浓度为1∶100，抗CD【sub】34【/sub】单克隆抗体工作浓度为1∶50，以PBS液(0.01mol/L，pH7.4)代替一抗作为阴性对照。DAB显色，苏木素复染，封片观察，按试剂盒说明操作。结果判定：以镜下细胞浆和细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞。采用全自动真色彩图像分析系统进行观察并半定量检测阳性物质的积分吸光度(IA)值(被测个体截面或投影轮廓或体积内IA值,即吸光物质的总含量，是阳性细胞着色面积及着色深度的综合体现)表示其含量，每张切片随机选择10个视野(×400)。
2.5 统计学方法
计量资料用(±s)表示，应用SPSS 12.0统计软件包进行单因素方差分析。
3 实验结果
3.1 前列腺指数、前列腺组织MVD
模型组、非那雄胺组、益气化瘀方各剂量组大鼠前列腺指数、前列腺组织MVD计数明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；益气化瘀方各剂量组和非那雄胺组大鼠前列腺指数、前列腺组织MVD计数明显低于模型组(P<0.05或P<0.01)；益气化瘀方中、高剂量组大鼠前列腺指数与非那雄胺组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，前列腺组织MVD计数明显低于非那雄胺组(P<0.05) ......
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