化瘀通络方对局灶性脑缺血大鼠再灌注(MCAO)后脑组织氧自由基和NOS表达的影响(2)
参见附件(12kb)。
1.5 实验统计
实验数据统计处理用±s表示,采用t检验,用SPSS 11.0统计软件进行统计分析。
2 实验方法
2.1 实验动物分组和MCAO模型的建立
选用健康雄性SD大鼠，体重280～320g，饲喂全价颗粒饲料，自由饮水，大鼠按简化分层随机法，随机分为6组：(1)假手术组: 给予等量生理盐水10mL/kg；(2)脑缺血再灌注模型组：给予等量生理盐水10mL/kg；(3)脑血康胶囊组：0.9g/kg，10mL/kg；(4)化瘀通络方大剂量组：16g/kg，10mL/kg；(5)化瘀通络方中剂量组：8g/kg，10mL/kg；(6)化瘀通络方小剂量组：4g/kg，10mL/kg。
以上除假手术组和脑缺血再灌注模型组给予等量生理盐水，其余各组大鼠灌胃给药，灌胃容量10ml/kg，每日一次，连续给药7天，实验前禁食不禁水，实验时以水合氯醛(30mg/kg)腹腔注射，待动物完全麻醉后，仰位固定于手术台上，颈部脱毛并消毒，于正中切开2cm，分离右侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)，颈内动脉(ICA)，结扎ECA和CCA近心端，于ECA和ICA分叉处在ECA上穿线打一活结。在ECA上剪一小口，插入直径0.235mm的尼龙渔线，缓慢向分叉处插入，直到到达分叉处有阻力不能再插入为止。将ECA上活结系紧，固定渔线。剪断ECA，轻轻提起ECA残端使其与ECA成一直线，再缓慢将渔线向ICA插入，栓线插入深度约为(18.0±1.0)mm，在分叉处结扎，松开动脉夹，缝合皮肤，体外留少许栓线，缺血2h后将栓线抽离颈总动脉分叉处造成再灌注模型。模型成功标志：动物麻醉清醒后出现缺血侧Hornor征及对侧以前肢为主的偏瘫。如动物无此体征或于2h后仍不清醒者剔除。假手术组只切开皮肤，分离CCA、ECA、ICA后缝合。手术后给予抗生素青霉素抗炎。继续给药3天。
2.2 实验指标检测
2.2.1 神经行为学评分 MCAO大鼠麻醉清醒后，进行行为学评分。评分标准参考Longa等5分制法(0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前肢；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。)分值越高，说明动物行为障碍越严重。观察造模后3h，24h，48h，72h神经功能行为学评分，见表1
表1 化瘀通络方对脑缺血大鼠神经行为学评分的影响
(±s)
注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
实验结果所示：局灶性脑缺血再灌注模型大鼠在3h、24h、48h、72h神经行为学评分高于各给药组，具有显著性差异；以3h神经行为学评分为重，24h～72h后神经行为有恢复，评分降低，化瘀通络方大剂量组在24h、48h和72h的神经行为学评分与模型组比较具有显著性差异；化瘀通络方中剂量组在24h和48h的神经行为学评分与模型组比较具有显著性差异；化瘀通络方小剂量组24h有显著性降低神经行为学评分作用，提示：化瘀通络方对局灶性脑缺血大鼠再灌注后的神经元具有一定的保护作用，并具有减轻神经功能损伤的作用。
2.2.2 脑组织标本的制备 各组大鼠再灌注72h后,脱颈处死,断头后迅速取脑,将脑组织以冰生理盐水洗净血迹后，称取0.1g，置2mL冰磷酸盐缓冲液中于匀浆器中进行匀浆，将制备好5%脑组织匀浆用离心机3000r/min，4℃离心15min，取上清液测定SOD、MDA、NOS和蛋白含量。
2.2.3 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中SOD、MDA、NOS的影响 见表2～3。
实验结果所示：局灶性脑缺血再灌注模型大鼠脑组织中MDA含量显著高于假手术组，SOD显著性低于假手术组，化瘀通络方各给药组均可不同程度降低局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织中MDA含量，升高SOD活力，与模型组比较具有显著性差异。提示：化瘀通络方对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织的保护作用与降低MDA含量和升高SOD
表2 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中MDA含量
和SOD活力的影响(±s)
注：与假手术组比较，△△P<0.01； 与模型组比较，*P<0.05，**P<0.05。
表3 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中TNOS
和iNOS的影响(±s)
注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。
活力有关。
实验结果提示：局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织中TNOS和iNOS含量明显增高，与假手术组比较具有显著性差异，(P<0.01)，脑缺血早期因TNOS和iNOS含量明显增高，进而使梗塞区加重。应用化瘀通络方治疗后，大剂量组和中剂量组均可明显减少TNOS和INOS含量。与模型组比较有显著性差异。提示：化瘀通络方对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织的保护作用与降低TNOS和INOS含量有关。
3 讨 论
关于缺血再灌注引起脑神经组织损伤的机制尚不十分清楚。近年研究发现自由基及其脂质过氧化反应在脑组织缺血再灌注的病理生理过程中发挥着重要作用，是脑缺血-再灌注损伤的重要机制之一 ......
1.5 实验统计
实验数据统计处理用±s表示,采用t检验,用SPSS 11.0统计软件进行统计分析。
2 实验方法
2.1 实验动物分组和MCAO模型的建立
选用健康雄性SD大鼠，体重280～320g，饲喂全价颗粒饲料，自由饮水，大鼠按简化分层随机法，随机分为6组：(1)假手术组: 给予等量生理盐水10mL/kg；(2)脑缺血再灌注模型组：给予等量生理盐水10mL/kg；(3)脑血康胶囊组：0.9g/kg，10mL/kg；(4)化瘀通络方大剂量组：16g/kg，10mL/kg；(5)化瘀通络方中剂量组：8g/kg，10mL/kg；(6)化瘀通络方小剂量组：4g/kg，10mL/kg。
以上除假手术组和脑缺血再灌注模型组给予等量生理盐水，其余各组大鼠灌胃给药，灌胃容量10ml/kg，每日一次，连续给药7天，实验前禁食不禁水，实验时以水合氯醛(30mg/kg)腹腔注射，待动物完全麻醉后，仰位固定于手术台上，颈部脱毛并消毒，于正中切开2cm，分离右侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)，颈内动脉(ICA)，结扎ECA和CCA近心端，于ECA和ICA分叉处在ECA上穿线打一活结。在ECA上剪一小口，插入直径0.235mm的尼龙渔线，缓慢向分叉处插入，直到到达分叉处有阻力不能再插入为止。将ECA上活结系紧，固定渔线。剪断ECA，轻轻提起ECA残端使其与ECA成一直线，再缓慢将渔线向ICA插入，栓线插入深度约为(18.0±1.0)mm，在分叉处结扎，松开动脉夹，缝合皮肤，体外留少许栓线，缺血2h后将栓线抽离颈总动脉分叉处造成再灌注模型。模型成功标志：动物麻醉清醒后出现缺血侧Hornor征及对侧以前肢为主的偏瘫。如动物无此体征或于2h后仍不清醒者剔除。假手术组只切开皮肤，分离CCA、ECA、ICA后缝合。手术后给予抗生素青霉素抗炎。继续给药3天。
2.2 实验指标检测
2.2.1 神经行为学评分 MCAO大鼠麻醉清醒后，进行行为学评分。评分标准参考Longa等5分制法(0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前肢；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。)分值越高，说明动物行为障碍越严重。观察造模后3h，24h，48h，72h神经功能行为学评分，见表1
表1 化瘀通络方对脑缺血大鼠神经行为学评分的影响
(±s)
注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
实验结果所示：局灶性脑缺血再灌注模型大鼠在3h、24h、48h、72h神经行为学评分高于各给药组，具有显著性差异；以3h神经行为学评分为重，24h～72h后神经行为有恢复，评分降低，化瘀通络方大剂量组在24h、48h和72h的神经行为学评分与模型组比较具有显著性差异；化瘀通络方中剂量组在24h和48h的神经行为学评分与模型组比较具有显著性差异；化瘀通络方小剂量组24h有显著性降低神经行为学评分作用，提示：化瘀通络方对局灶性脑缺血大鼠再灌注后的神经元具有一定的保护作用，并具有减轻神经功能损伤的作用。
2.2.2 脑组织标本的制备 各组大鼠再灌注72h后,脱颈处死,断头后迅速取脑,将脑组织以冰生理盐水洗净血迹后，称取0.1g，置2mL冰磷酸盐缓冲液中于匀浆器中进行匀浆，将制备好5%脑组织匀浆用离心机3000r/min，4℃离心15min，取上清液测定SOD、MDA、NOS和蛋白含量。
2.2.3 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中SOD、MDA、NOS的影响 见表2～3。
实验结果所示：局灶性脑缺血再灌注模型大鼠脑组织中MDA含量显著高于假手术组，SOD显著性低于假手术组，化瘀通络方各给药组均可不同程度降低局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织中MDA含量，升高SOD活力，与模型组比较具有显著性差异。提示：化瘀通络方对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织的保护作用与降低MDA含量和升高SOD
表2 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中MDA含量
和SOD活力的影响(±s)
注：与假手术组比较，△△P<0.01； 与模型组比较，*P<0.05，**P<0.05。
表3 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中TNOS
和iNOS的影响(±s)
注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。
活力有关。
实验结果提示：局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织中TNOS和iNOS含量明显增高，与假手术组比较具有显著性差异，(P<0.01)，脑缺血早期因TNOS和iNOS含量明显增高，进而使梗塞区加重。应用化瘀通络方治疗后，大剂量组和中剂量组均可明显减少TNOS和INOS含量。与模型组比较有显著性差异。提示：化瘀通络方对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织的保护作用与降低TNOS和INOS含量有关。
3 讨 论
关于缺血再灌注引起脑神经组织损伤的机制尚不十分清楚。近年研究发现自由基及其脂质过氧化反应在脑组织缺血再灌注的病理生理过程中发挥着重要作用，是脑缺血-再灌注损伤的重要机制之一 ......
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